胀果甘草的简便快速鉴定方法

木合布力·阿布力孜， 王永波， 施翔弋,2， 热娜·卡斯木

(1新疆医科大学药学院药化有机教研室， 乌鲁木齐 830011； 2上海中医药大学中药学院， 上海 201210)

甘草(Glycyrrhizarout)是多年生草本植物，药用其根与根茎。在我国甘草药用历史悠久，得到广泛的应用。传统医学认为其有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效。甘草的品种较多，而《中国药典》(2010 年版一部)记载其原植物有 3 种，即乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL)，其中胀果甘草在新疆、甘肃等西部地区的分布资源较为丰富[1]。

甘草的化学成分是其药用功效的主要物质基础。国内外已从甘草中分离出100多种黄酮类化合物、60多种三菇类化合物及香豆素类、18种氨基酸、多种生物碱、雌激素类和多种有机酸等[2]。然而，不同种类甘草的化学成分有一定的区别，故其药用价值可能不完全相同。因此，在甘草的资源考察和药用研究中，对其品种鉴定是非常重要的。甘草的品种鉴定一般包括药材全草的形态鉴定及药材粉末的纤维鉴定等较系统而复杂的生药鉴定方法。此方法有时在无全草鉴定辅助的条件下可产生一定的误差。崔淑芬等[3]报道了一种准确度较高而程序较复杂的微乳薄层鉴别法。对不同品种甘草的简便快速的鉴定方法的报道很少。本研究利用胀果甘草中的特殊黄酮类成分甘草查尔酮A为对照品，以简便的薄层色谱法快速鉴别胀果甘草品种的实验方法进行研究，并获得较满意的实用性结果，方法准确性和重现性都高，可为中药材甘草的快速品种鉴定、资源考察及产品的质量控制提供简便有效的辅助手段及参考依据。

1 材料与仪器

1.1 药材

新疆胀果甘草(3份样本于2012年8月分别采集于新疆甘草资源较丰富的巴楚县、新和县、和静县基地，并编号为GC-1、GC-2、GC-3)；光果甘草(2012年8月采集于新疆巴楚，编号GC-4)。以上甘草样本根据药材特征初步鉴定品种，新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授进行生药学品种鉴定为胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL)。

1.2 仪器与试剂

Unity-Inova600超导核磁共振谱仪(美国Varian公司)，IR Prestige-21红外光谱仪(SHIMADZU)，AB104-N电子天平(Mettler-Toledo Group)，DT200型电子分析天平(常熟市衡器厂)，SHB-111A型循环水式多用真空泵(郑州长城科共贸有限公司)，SK2510HP型数控超声清洗仪(上海科导超声仪有限公司)，N-1001型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，ZF-20C暗箱式紫外分析仪(上海宝山顾村电光仪器厂)，WRS-1A型数字式熔点测定仪(上海精密科学仪器有限公司)，HH-S恒温水浴锅，粉碎机，进口硅胶薄层GF254层析板(德国Merck)。

无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、1,2-二氯甲烷等均为分析纯；柱层析硅胶(60-100目，青岛康业鑫)，甘草查尔酮A对照品(美国Sigma公司，批号803529)，蒸馏水(新疆医科大学蒸馏水供应中心提供)。

2 方法与结果

2.1 甘草总黄酮提取物的制备

将不同产地的干燥胀果甘草根(GC-1～3)分别经粉碎和过20目筛后，各取粉末1 g，在10 mL的75%乙醇中室温浸泡10 min后，放入水浴锅中，60℃下超声5 min后继续加温提取15 min，并过滤，得约6 mL的供试品溶液，分别编号为T-A1(提取物A1，巴楚胀果甘草GC-1)、T-A2(新和GC-2)和T-A3(和静GC-3)。再称取已鉴定的光果甘草药材粉末1 g，按同法制备提取物B(T-B，巴楚GC-4)，备用。

2.2 甘草查尔酮A对照品溶液的制备

取甘草查尔酮A对照品约2 mg，溶解于适量75%的乙醇中，制成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液备用。

2.3 甘草总黄酮提取物的薄层鉴定

利用毛细管，将以上所制备的4种总黄酮粗提物溶液(3种胀果甘草提取物T-A1、T-A2、T-A3和光果甘草提取物T-B)及对照品溶液，分别点样于1张进口硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶3∶1)混合展开剂进行展开，并在紫外灯下观察薄层斑点特征。

2.4 胀果甘草总黄酮中特殊斑点的分离鉴定

称取已鉴定的干燥胀果甘草根粉末10 g，在100 mL的75%乙醇中室温浸泡2 h后，放入水浴锅中，60℃加温提取2 h并过滤，得65 mL的提取液，减压浓缩至稠膏状，利用自制的硅胶制备薄层板(20 cm×20 cm，0.3 mm)进行展开[1,2-二氯乙烷∶甲醇∶乙酸乙酯(3∶0.5∶1)]，在紫外光下显色，对具有甘草查尔酮A斑点特色的色带划线标记，并用刀片刮取，用甲醇提取，减压浓缩至干，黄色提取物固体用乙酸乙酯-石油醚重结晶，得少量亮黄色针状结晶，过滤，干燥，并用光谱方法进行结构鉴定。

2.5 结果

2.5.1 不同产地的3种胀果甘草薄层色谱特征 不同产地的3种胀果甘草总黄酮粗提物T-A1、T-A2、T-A3的薄层色谱特征(硅胶GF254板，展开剂为乙酸乙酯∶甲酸∶水=8∶3∶1)：3种提取物的薄层斑点上，至少有10个斑点，其中上端有7～8个紫外荧光特征的斑点；提取物都具有与对照物甘草查尔酮A(LicoA)相应的亮黄色荧光斑点(Rf=0.79)，即适合胀果甘草特征，见图1。

2.5.2 胀果甘草与光果甘草提取物的薄层色谱特征比较 胀果甘草与光果甘草提取物中黄酮类化合物的组成有差异，其中光果甘草总黄酮提取物中不显甘草查尔酮A(LicoA)的斑点特征(图2)。显示本实验所建立的薄层色谱鉴定法在胀果甘草和光果甘草品种的快速鉴定中具有使用价值。

2.5.3 单体成分的光谱鉴定结果 经薄层鉴定结果可观察到，不同产地的胀果甘草乙醇提取物中都具有符合于甘草查尔酮A的1个亮黄色荧光斑点。经制备薄层法分离纯化并重结晶后获得其与对照品相似的亮黄色针状结晶，经理化鉴定和光谱鉴定后，获得单体化合物的鉴定数据如下：金黄色针状结晶(乙酸乙酯-石油醚)，紫外灯下呈亮黄色荧光，m.p.：155.7～157.6℃，易溶于氯仿、乙酸乙酯，溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于石油醚，不溶于水。盐酸-镁粉反应显微红色，与FeCl3溶液反应生成黄色沉淀，遇碱性显色试剂显橙色，遇到硫酸显桔红色。IR(红外光谱，KBr压片)υcm-1：3217，2964，1650，1604，1587，1556，1510，1446，1346，1290，1261，1215，1166，1078，1039，1006，904，837。1H-NMR(核磁共振谱，Varian 600, CDCl3) δppm：8.03(1H，d，J=16 Hz，H-β)，7.98(2H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)，7.58(1H，d，J=16Hz，H-α)，7.47(1H，s，H-6)，6.96(2H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)，6.45(1H，s，H-3)，6.20(1H，dd，J=18，10Hz，H-2″)，5.35(1H，dd，J=18.1Hz，H-3″)，5.32(1H，dd，J=10.1Hz，H-3″)，3.87(3H，s，OCH3)，2.19(2H，s，OH-4，4′)，1.45(6H，s，CH3-4″，5″)。甘草查尔酮A的化学结构如图3所示。 NMR谱中观察到8.03(1H，d，J=16Hz，H-β)和7.58(1H，d，J=16Hz，H-α)，为典型的查尔酮特征信号。氢谱还给出一组AA′XX′偶合的A环芳氢信号7.98(2H，d，J=8.5Hz，H-2′，6′)和6.96(2H，d，J=8.5Hz，H-3′，5′)，以及B环2个孤立芳环质子信号7.47(1H，s，H-6)和6.45(1H，s，H-3)。此外，氢谱还给出1组末端双键质子信号6.20(1H，dd，J=18，10Hz，H-2″)、5.35(1H，dd，J=18.1Hz，H-3″)和5.32(1H，dd，J=10.1Hz，H-3″)，1个甲氧基信号3.87(3H，s，OCH3)，2个酚羟基信号2.19(2H，s，OH-4，4′)以及2个甲基信号1.45(6H，s，CH3-4″，5″)。以上鉴定结果与文献[4]报道的一致。因此，将此单体成分鉴定为甘草查尔酮A(结构式如图3所示)。

3 讨论

胀果甘草是甘草品种之一，主要分布于新疆、甘肃、内蒙古一带，是《中国药典》2010版收录的甘草药用品种之一。近期研究显示，胀果甘草中的总黄酮具有较明显的抗癌活性，其中尤其是对人宫颈癌细胞的增殖显示明显强的抑制活性，并能促进癌细胞凋亡[5]。近期的实验研究显示，胀果甘草中特有的查尔酮类单体成分——甘草查尔酮A显示明显的抗宫颈癌、抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌细胞的扩散转移[6-8]。这些研究结果促进了胀果甘草在抗癌新药研究中的潜在价值。然而，市售的甘草根因为产地和原植物形态不明而较难以确定其品种特征，需要进行较复杂的生药学鉴定才能确定。

崔淑芬等[3]利用微乳薄层色谱法对《中国药典》收录的乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草3种甘草品种进行鉴定，并提出与对照品甘草查尔酮A相对应的斑点只存在于胀果甘草中，从而进一步确定甘草查尔酮A是胀果甘草中的种属特异性成分。然而微乳薄层方法需要进行较复杂的操作程序，对仪器设备要求也较高且耗时。

作为胀果甘草中种属特异性成分之一的单体化合物甘草查尔酮A主要存在于胀果甘草中。本实验中，利用简单的硅胶薄层色谱法，以甘草查尔酮A为对照品来对新疆胀果甘草进行快速色谱鉴定的研究，并建立胀果甘草的快速品种鉴定的方法。利用胀果甘草中的种属特异性成分甘草查尔酮A为对照品，对新疆不同产地胀果甘草根的薄层色谱特点进行鉴定观察，并将之与新疆分布较广的另一种甘草品种光果甘草进行对比分析。同时利用制备薄层方法，对胀果甘草样品中符合甘草查尔酮A的薄层斑点进行分离纯化及结构鉴定，确定是否为甘草查尔酮A，从而进一步验证鉴定效果。在操作中，首先以甘草查尔酮A为对照品，对摘自不同产地并已鉴定品种的3种胀果甘草根样品用75%乙醇提取制备提取物(主要为总黄酮类粗品)，并进行薄层色谱鉴定，结果发现，3种胀果甘草样品中都具有很明显的查尔酮A亮黄色荧光斑点，以此对胀果甘草总黄酮类提取物的薄层色谱斑点特征进行较系统的描述。进一步利用制备薄层法，将适合于甘草查尔酮A对照品特征的样品斑点(色带)进行分离纯化，利用光谱方法确定其化学结构为甘草查尔酮A，从而进一步确定适合于对照品特征的样品斑点确实为甘草查尔酮A。同时制备另一种甘草品种光果甘草的乙醇提取物，在薄层板上在相同条件下与胀果甘草提取物平行展开，观察2种甘草品种的薄层色谱斑点特征，发现2种甘草品种的薄层色谱特点明显不同，尤其是光果甘草乙醇提取物在薄层板上不存在适合于甘草查尔酮A的斑点。此结果与采用微乳薄层方法的结果一致[3]。关于薄层展开剂的溶剂选择及其比例筛选方面，经反复多次摸索，最后确定混合展开剂的组成和比例为乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶3∶1)。本课题组前期研究详细描述了从新疆胀果甘草中高效制备甘草查尔酮A对照品的方法。本实验结果说明，以甘草查尔酮A为对照品的薄层色谱法是简便快速鉴定胀果甘草品种的一种有效鉴定方法，此结果对胀果甘草的快速品种鉴定、甘草的资源考察研究以及其产品的质量控制将具有一定的参考价值。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中国药典2010[S]. 一部. 北京:化学工业出版社, 2010:80-81.

[2] 陶哺，刘晓清，屈振刚.甘草化学成分研究进展[J]. 河北农业科学，2009,3(13)：77-79.

[3] 崔淑芬，林焕冰，Frank SCL, 等.微乳薄层法鉴别甘草的研究[J]. 中药材，2007,38(4)：540-542.

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[5] Guo X, Matsidik R, Ablise M, et al. Anti-cancer activity of flavonoids from Xinjiang Glycyrrhiza inflata Licorice on proliferation, cytotoxicity and apoptosis in cervical carcinoma cells[J]. J Med Plants Res, 2013, 7(5):173-178.

[6] Yi TY, Gia SS, Keng FH, et al. Licorice and licochalcone-a induce autophagy in LNCaP prostate cancer cells by suppression of Bcl-2 expression and the mTOR pathway[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57:8266-8273.

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