大蒜冻干粉高效液相色谱指纹图谱研究

耿 晶， 赵东升,， 张海波， 陈 坚， 李新霞

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011; 2新疆埃乐欣药业有限公司， 乌鲁木齐 830013)

大蒜(AlliumSativumL.)为百合科葱属多年生草本植物，是历史悠久的药食两用植物[1]。《名医别录》(梁)、《新修本草》(唐)、《古今注》、《普济方》、《本草纲目》(明)等古医术中均有记载，指出大蒜具有通五脏、达诸窍、去寒湿、避邪恶、消臃肿、化积食等功能[2]。现代医学研究表明，大蒜不但具有抗菌[3]、消炎[4]等药理作用，还具有降血压[5]、降血脂[6]、抗肿瘤[7]、防止动脉粥样硬化[8]、抑制血小板聚集[9]、调节机体免疫力[10]等功效。大蒜经压碎或碾碎后，蒜酶反应系统处于激活状态，组织细胞破裂，处在液泡中的蒜酶被释放出来，催化细胞质中的蒜氨酸裂解产生大蒜辣素，而大蒜辣素极不稳定，会进一步分解[11]。大蒜冻干粉是大蒜经过冷冻干燥制成的粉末，可保留大蒜的活性成分，可作为大蒜制剂的原料药。近几年，国内多个厂家都对大蒜冻干粉进行研究和生产，《英国药典》、《欧盟药典》和《美国药典》对大蒜粉均有收录。

本研究依据高效液相色谱图中色谱峰的保留时间、峰面积及整个高效液相色谱指纹图谱的相似性来进行分析，旨在建立大蒜冻干粉高效液相色谱指纹图谱，采用数学分析方法提取与表达指纹图谱提供的物质群特征成分信息。

1 仪器与试药

1.1主要仪器高效液相色谱仪(e2695型，美国Waters公司)，紫外检测器(2489，美国Waters公司)，分析天平(BS 110 s，d=0.1 mg，德国Sartorius公司)，低温离心机(Multifugex-3R，美国Thermo公司)，超声波清洗仪(200 W，40 KHz，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药大蒜冻干粉(新疆医保公司提供)，甲醇(色谱纯，美国sigma公司)，无水甲酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1供试品溶液制备称取大蒜粉约0.8 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加水20.0 mL，超声(冰水浴)5 min，取出，室温放置30 min，离心(离心力12 000×g，4℃)30 min，移取上清液10.0 mL，置25 mL容量瓶，甲醇-1%无水甲酸水溶液(60∶40)稀释并定容至刻度，振摇混匀，离心(离心力12 000×g，4℃)5 min，取上清液作为供试品溶液。

2.2色谱条件色谱柱:SHIMADZU VP-ODS色谱柱(4.6 μm × 25 cm)，流动相:1%无水甲酸和甲醇梯度洗脱，洗脱程序：0 min →6 min →8 min →12 min →18 min →25 min →28 min →30 min，甲醇10%→30%→35%→35%→50%→80%→10%→10%；流速:1.0 mL/min；检测波长:254 nm；柱温:35 ℃；进样量:10 μL，运行时间：30 min。

2.3共有峰的标定根据典型色谱图，标定出分离良好的色谱峰为共有峰，共9个(图1)。

图1 大蒜冻干粉典型色谱图

2.4指纹图谱试验的方法学验证

2.4.1 精密度试验 取1份大蒜粉供试品溶液，连续进样5次，以主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积为指标计算RSD，考察其精密度。结果，各个色谱峰相对保留时间RSD(%)在0.02%～0.22%范围内，相对峰面积RSD(%)在1.08%～4.73%范围内。结果表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批大蒜粉5份，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，以主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积为指标分别计算RSD，考察方法的重复性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD(%)在0.06%～1.66%范围内，相对峰面积RSD(%)在1.29%～5.97%范围内。结果表明供试品制备方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同1份大蒜粉供试品溶液，分别在0、0.5、1、2、4、8、12 h进样，以主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积为指标分别计算RSD，考察大蒜药材供试品溶液的稳定性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD(%)在0.02%～1.11%范围内，相对峰面积RSD(%)在0.19%～5.31%范围内。结果表明大蒜供试品溶液在12 h内保持稳定。

2.5指纹图谱及技术参数

2.5.1 指纹图谱及共有峰的标定 将10个批次大蒜冻干粉制成供试品溶液后进行测定，冻干粉中各成分的色谱峰在30 min之内出完，应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统))(2004A版)比较10个批次大蒜冻干粉的色谱图，其中有9个色谱峰是共有的，确定为共有峰(图1)，10个批次大蒜冻干粉指纹图谱比较见图2。

2.5.2 共有峰的保留时间及峰面积 10个批次大蒜冻干粉共有峰保留时间差异较小，峰面积差异较大，说明10个批次冻干粉成分含量有差别(表1、2)。

图2 大蒜冻干粉指纹图谱

表1 不同批次大蒜冻干粉共有峰保留时间

表2 不同批次大蒜冻干粉共有峰峰面积

2.5.3 相似度评价结果 应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统))(2004A版)[12]对10个批次大蒜冻干粉的色谱图进行相似度评价，其相似度均>0.96，说明不同批次大蒜冻干粉化学组成一致性较好。10个批次大蒜冻干粉相似度评价结果见表3。

3 讨论

指纹图谱是中药液相色谱图谱的特征峰色谱，能够反映中药材整体的化学信息，目前是比较科学的控制中药材质量的可行策略。因此，对大蒜冻干粉HPLC指纹图谱进行研究，旨在有效地控制大蒜冻干粉的质量。

本研究参考本课题组自建大蒜药材含硫化合物类物质群HPLC的色谱条件，建立了的指纹图谱，色谱峰分离良好，并指认出6号峰为大蒜公认活性物质——大蒜辣素峰，基线平稳，信息量丰富，峰的数目、强度较为理想(图1)，几乎可以呈现大蒜冻干粉化学成分的全貌，并经过方法学的验证，结果符合指纹图谱的技术要求。

表3 不同批次大蒜冻干粉相似度

从不同批次色谱图(图2)来看，色谱图概貌一致，经相似度分析评价(表3)，其相似度均>0.96，说明不同批次化学组成一致性较好，但是不同批次共有峰峰面积差异较大，表明所含成分的含量有差异。

参考文献:

[1] Ichikawa M, Ide N, Yoshida J, et al. Determination of seven organosulfur compounds in garlic by high-performance liquid chromatography[J]. J Agr Food Chem, 2006, 54(5):1535-1540.

[2] 中国国家中医药管理局.中华本草:第八册[M]．上海：上海科技出版社，1999：36-43．

[3] Uchida Y, Takahashi T, Sato N. The characteristics of the antibacterial activity of garlic[J]. J Antibiot, 1975, 28(4):638-642.

[4] Chang HP, Chen YH. Differential effects of organosulfur compounds from garlic oil on nitric oxide and prostaglandin E2 in stimulated macrophages[J].Nutrition. 2005, 21(4):5302-5361.

[5] Silagy CA, Neil HA. A meta-analysis of the effect of garlic on blood pressure[J]. J Hyperten, 1994, 12(4):463-468.

[6] Stevinson C, Pittler M H, Ernst E. Garlic for treating hypercholesterolemia. A meta-analysis of randomized clinical trials[J]. Ann Int Med, 2000, 133(6):420-429.

[7] Wu X, Kassie F, Mersch-Sundermann V. Induction of apoptosis in tumor cells by naturally occurring sulfur-containing compounds[J]. Mutat Res, 2005, 589(2):81-102.

[8] Ferri N,Yokoyama K,Sadilek M,et al.Ajoene, a garlic compound, inhibits protein prenylation and arterial smooth muscle cell proliferation[J]. Bri J Pharmacol, 2003, 138(5):811-818.

[9] Chang HS, Yamato O, Sakai Y, et al. Acceleration of superoxide generation in polymorphonuclear leukocytes and inhibition of platelet aggregation by alk(en)yl thiosulfates derived from onion and garlic in dogs and humans[J]. Prostag Leukotr Ess, 2004, 70(1):77-83.

[10] Abdullah TH, Kandil O, Elkadi A, et al. Garlic revisited:therapeutic for the major diseases of our times[J]. J Nati Med Associ, 1988, 80(4):439-445.

[11] Josling P. Allicin& VitaminC-Power, performance, proof[M]. America:HRC Publications, 2010:12-14.

[12] 杨瑾，陈坚，李新霞，等．高效液相衍生化法测定大蒜氨基酸指纹图谱[J]．新疆医科大学学报，2010，33(5)：509-511．