甲泼尼龙对脊髓持续压迫节段神经细胞凋亡影响的动物实验

高 博，董明岩，于 洋，关 鑫，高 平辽宁医学院附属第一医院 骨科脊柱病区，辽宁锦州 000；锦州市卫生监督所 传染病科，辽宁锦州 000

甲泼尼龙对脊髓持续压迫节段神经细胞凋亡影响的动物实验

高 博1，董明岩1，于 洋1，关 鑫1，高 平2
1辽宁医学院附属第一医院 骨科脊柱病区，辽宁锦州 121000；2锦州市卫生监督所 传染病科，辽宁锦州 121000

目的探讨甲泼尼龙(methylprednisolone，MP)对脊髓持续受压节段神经细胞的保护作用。方法选取成年日本大耳白兔145只，空白组5只，手术组和MP治疗组各70只。空白组取颈后正中切口，逐层钝性剥离肌肉组织，不予脊髓压迫，缝合切口；手术组和MP治疗组均在颈后路C6、C7间隙拧入平头螺钉造成脊髓轻度压迫，7 d后开始减压，MP治疗组在脊髓受压30 min时经耳缘静脉注射大剂量MP，手术组在脊髓受压30 min时仅注射0.9%氯化钠注射液。脊髓受压6 h、 24 h、3 d、7 d以及脊髓减压3 d、7 d、14 d时取压迫段脊髓行透射电镜观察神经细胞凋亡，流式细胞术检测脊髓神经细胞凋亡率和免疫组化检测凋亡相关Bax蛋白的表达情况。结果手术组和MP组在压迫6 h时均出现神经细胞凋亡，两组神经细胞凋亡率在脊髓受压3 d时达最大值，但MP组细胞凋亡率数值在各时间点均低于手术组，脊髓减压后MP组和手术组神经细胞凋亡率均降低，且各减压时间点神经细胞凋亡率有统计学差异。结论早期给予MP可以降低脊髓持续受压节段神经细胞凋亡率，脊髓压迫减压术联合MP可以保护受压脊髓神经功能。

甲泼尼龙；脊髓压迫；凋亡

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是常见的中枢神经系统损伤，甲泼尼龙(methylprednisolone，MP)因其抗脂质氧化作用而对急性脊髓损伤的神经具有保护作用，大剂量MP冲击疗法治疗急性脊髓损伤已经得到广泛应用[1]。但是在临床实践中，由于大多数脊髓损伤患者并不能立即接受脊髓减压治疗而使脊髓处于持续受压状态。为探讨在脊髓持续压迫早期大剂量MP冲击疗法对脊髓持续压迫节段神经细胞凋亡的影响及其对脊髓压迫节段神经细胞的保护作用，设计本实验。

材料和方法

1 材料 高温高压消毒平头螺钉，长8 mm，直径2 mm，螺距0.25 mm；甲泼尼龙；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒(SP超敏试剂盒)。

2 动物及分组 日本大耳白兔145只，6月龄，体质量(2.9±0.1) kg，性别不限，辽宁医学院实验动物中心提供。分为A、B、C 3组，A组(5只)为空白对照组，B组(70只)为手术组，C组(70只)为MP治疗组。

3 实验方法 各组动物术前单笼饲养7 d，术前行动物脊髓损伤评分(BBB评分)，有神经功能障碍的动物给予排除。预实验期间解剖相同体质量的日本大耳白兔，测量C7椎体内径，并计算不同压迫深度对脊髓的压迫率。

4 手术操作 所有实验动物术前禁食8 h，饮水正常供给。兔全身麻醉，固定于自制兔固定架上。手术区域碘伏消毒3次，铺无菌洞巾。A组(空白组)以C7棘突为中心沿后正中线做长约5 cm的切口，钝性剥离肌肉组织，注意保护血管以免造成大量失血，暴露C6、C7和T1棘突不给予脊髓压迫即逐层缝合切口，0.9%氯化钠注射液冲洗伤口，碘伏消毒后加压包扎。B组(手术组)手术切口同A组，逐层钝性剥离肌肉暴露C6、C7和T1棘突后将钝头螺钉拧入C6和C7间隙但不能向下触及脊髓，若此时实验动物双下肢出现抽搐则表明螺钉已经压迫脊髓，应给予排除，选择神经功能正常兔给予补充。C组(MP治疗组)手术切口同A组，螺钉拧入节段和B组相同，亦不能向下触及脊髓，若拧入螺钉时实验动物双下肢抽搐则选择神经功能正常兔给予补充。手术切口闭合后，各组动物单笼饲养，正常饮食。

5 脊髓压迫模型制作 B、C两组术后观察24 h行动物脊髓损伤评分(BBB评分)，确认无神经功能损伤，开始制作脊髓压迫模型[2]。打开手术切口将螺钉缓慢拧入1 mm(0.25 mm/min)对兔脊髓造成轻度压迫，碘伏消毒，闭合切口，加压包扎，单笼饲养。为确认脊髓压迫程度，在脊髓受压6 h和24 h两个时间点行BBB评分，排除不符合轻度压迫的实验动物并予补充[2]。B、C两组均压迫7 d

后开始减压。各组实验动物术后均一次性给予青霉素800 kU肌肉注射预防感染，每天早、中、晚3次按摩膀胱，促进排尿。

6 脊髓压迫后处理 A组术后正常饲养。B组在螺钉压迫脊髓后30 min经耳缘静脉注射0.9%氯化钠注射液(30 mg/kg)。C组在螺钉压迫脊髓后30 min经耳缘静脉注射MP(30 mg/kg)[3]。B、C两组兔脊髓压迫7 d后给予减压。在脊髓压迫6 h、24 h、3 d、7 d以及脊髓减压后3 d、7 d、14 d时随机选取10只兔，行BBB评分并取手术节段脊髓送检。脊髓损伤BBB评分：各组实验动物在术前、术后24 h及各取材时间点行脊髓损伤BBB评分。

7 透射电镜观察神经细胞凋亡 B、C两组在对应时间点分别随机选取10只实验动物，快速取出压迫段脊髓组织，切成1 mm3小块固定脱水，环氧树脂包埋，37℃、45℃、60℃依次聚合24 h，超薄切片后行醋酸铀和枸橼酸铅双染2 min，烘干后电镜观察。

8 流式细胞术检测神经细胞凋亡率 压迫段脊髓组织剪碎后放入组织研磨器中，滴加2 ml 0.9%氯化钠注射液研磨至匀浆，加10 ml 0.9%氯化钠注射液过滤后700 r/min离心沉淀2 min，0.9%氯化钠注射液冲洗2次离心沉淀1次，备用。行流式细胞仪检测，弃上清液，PBS冲洗2次，Annexin V 400 ml结合细胞悬液，细胞密度1×106/ml。5 μl Annexin V FITC染色液滴加到细胞悬浮液中，混匀，4℃避光孵育15 min，加10 μl碘化丙啶(PI)染色液，混匀后4℃避光孵育5 min，流式细胞仪检测。

9 免疫组化检测Bax蛋白阳性细胞百分率 5 μm厚压迫段脊髓切片置于防脱载玻片上。脱蜡后酒精梯度脱水，抗原修复2 min，依次滴加一抗(1∶100稀释后兔抗兔多克隆抗体)和二抗(山羊抗兔IgG)，滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶后DAB显色，苏木素复染，脱水，封片，显微镜下观察。Bax蛋白表达阳性细胞的标准为细胞呈黄色或黄棕色。

10 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件处理各组实验数据。数据采用±s表示，对各组数据进行单因素方差分析，α=0.05为检验水准，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各时间点脊髓损伤BBB评分 各实验动物术前BBB评分显示无神经功能损伤，术后24 h神经功能正常，证明术中未伤及脊髓组织，无急性脊髓损伤发生，脊髓受压后BBB评分下降，压迫6 h及24 h评分符合脊髓轻度压迫[4]。B组和C组相比，脊髓受压期间及减压3 d的BBB评分差异无统计学意义(P＞0.05)，减压7 d和14 d评分差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2 脊髓受压节段神经细胞凋亡 透射电镜观察显示B、C两组压迫6 h时均出现神经细胞凋亡。见图1。

图 1 脊髓受压6 h时电镜显示神经细胞凋亡A：手术组神经细胞凋亡(×5 000)； B：MP治疗组神经细胞凋亡(×5 000)Fig. 1 Apoptosis of neurons after 6 h spinal cord compression A: Apoptosis of neurons in control group (×5 000); B: Apoptosis of neurons in MP treating group (×5 000)

表1 手术组和MP治疗组兔脊髓损伤BBB评分Tab. 1 BBB score of spinal cord injury rabbits in control group and MP treating group (±s)

表1 手术组和MP治疗组兔脊髓损伤BBB评分Tab. 1 BBB score of spinal cord injury rabbits in control group and MP treating group (±s)

TimeControl group (n=10) MP treating group (n=10)P Before operation2121 After operation 24 h2121 Compression 6 h17.4±0.5517.4±1.141.000 Compression 24 h17.2±0.8417.0±0.710.694 Compression 3 d14.6±0.5514.4±0.550.580 Compression 7 d9.4±0.559.6±0.550.580 Decompression 1 d9.4±0.559.6±0.550.580 Decompression 3 d10.2±0.4510.4±0.550.545 Decompression 7 d10.60±0.8912.6±0.550.003 Decompression 14 d11.60±0.8915.00±0.710.000

3 各时间点神经细胞凋亡率 流式细胞学检测B、C两组脊髓受压后神经细胞凋亡率均上升，各时间点C组凋亡率数值均低于B组，且C组在减压期间细胞凋亡率降低速率高于B组，手术组和MP治疗组在压迫6 h至减压14 d这一时间段神经细胞凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2，图2。4 Bax蛋白表达阳性细胞率 免疫组化Bax蛋白表达阳性细胞为黄色或黄棕色，统计Bax阳性细胞数B组多于C组，手术组和MP治疗组在压迫24 h至压迫7 d这一时间段Bax蛋白阳性细胞率差异有统计学意义(P＜0.05)，压迫6 h和减压期间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2，图3。

讨 论

目前MP治疗脊髓损伤的时间点有两个：一为脊髓损伤后8 h，目的为减轻脊髓组织水肿和炎性反应；二为围术期，多选择在术前30 min，目的在于减轻脊髓组织的缺血再灌注损伤[5-7]。但亦有文献报道行MP冲击治疗与未行MP治疗的患者神经功能恢复差异无统计学意义[8-9]。本实验中观察到，早期给予MP治疗不能推迟受压节段神经细胞开始发生凋亡的时间，手术组和MP治疗组在压迫6 h时均出现神经细胞凋亡，与文献报道相符[10]。Bax蛋白作为调节细胞凋亡的主要蛋白，在本实验中其变化幅度和神经细胞凋亡率呈正相关[11-12]。在脊髓压迫早期，手术组和MP组神经细胞凋亡率和Bax蛋白阳性细胞数均增高，在脊髓减压阶段两组神经功能均明显改善，神经细胞凋亡率降低，Bax蛋白阳性细胞数降低；但MP治疗组细胞凋亡情况轻于手术组(P＜0.05)；脊髓减压后MP治疗组神经功能恢复好于手术组，减压7 d、14 d BBB评分、细胞凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05)。在脊髓受压节段，MP组虽然给予了药物治疗，但是脊髓损伤因素持续存在，因此MP组与手术组相比在脊髓压迫阶段和减压后3 d内BBB评分差异无统计学意义。当脊髓减压7 d时，MP组恢复情况则优于手术组(P＜0.05)。可以认为在脊髓持续受压早期给予大剂量MP治疗可以保护神经细胞，降低神经细胞的凋亡率，对于减压后的神经功能恢复有促进作用[13-16]。

表2 压迫段脊髓神经细胞凋亡率和表达Bax蛋白阳性细胞率Tab. 2 Apoptosis rate of compression neurons and the positive rate of Bax- protein (±s)

表2 压迫段脊髓神经细胞凋亡率和表达Bax蛋白阳性细胞率Tab. 2 Apoptosis rate of compression neurons and the positive rate of Bax- protein (±s)

TimeNeurons apoptosis rate (%)Positive rate of Bax-protein (%) Control (n=10) MP treating (n=10)PControl (n=10)MP treating (n=10)P Compression 6 h26.90±0.5718.80±0.850.00813.98±2.0013.33±1.660.554 Compression 24 h33.87±1.0723.89±0.790.00918.73±2.3315.03±2.410.022 Compression 3 d38.74±1.2430.50±0.570.01122.67±2.3119.04±1.850.001 Compression 7 d36.15±0.6427.47±2.480.02920.65±3.4516.38±2.860.042 Decompression 3 d34.32±0.6624.43±1.750.01718.76±2.7915.73±2.290.067 Decompression 7 d28.15±1.2020.70±0.850.01912.17±1.0111.72±0.830.436 Decompression 14 d20.05±0.6416.05±0.350.01710.52±0.969.77±0.790.169

图 2 受压节段减压期间细胞凋亡流式细胞术检测结果 A、B、C为手术组减压3 d、7 d、14 d时流式细胞术检测结果； D、E、F为MP治疗组减压3 d、7 d、14 d时流式细胞术检测结果Fig. 2 Flow cytometry showing apoptosis of neuron cells after spinal cord decompression A, B, C: Apoptosis for spinal cord decompression at 3 d, 7 d, 14 d in control group; D, E, F: Apoptosis for spinal cord decompression at 3 d, 7 d, 14 d in MP treating group

图 3 脊髓受压3 d时免疫组化检测Bax表达阳性细胞 A：手术组压迫3 d时Bax蛋白表达阳性细胞(×400)； B： MP组压迫3 d时Bax蛋白表达阳性细胞(×400)Fig. 3 Expression of Bax protein after spinal cord compression at day 3 detected by immunohistochemical study A: Expression of Bax protein in control group (×400); B: Expression of Bax protein in MP treating group (×400)

本实验研究中，脊髓受压30 min即给予MP治疗。美国急性脊髓损伤研究会(NASCISⅡ)认为脊髓损伤后8 h内均属于MP治疗的时间窗[17]。但研究显示，脊髓持续受压6 h时即有神经细胞凋亡发生[5]。Hall等[18]报道脊髓损伤后4.5 h给予MP不能有效治疗脊髓损伤。本次实验数据支持神经细胞受压6 h即开始凋亡的情况。笔者认为，MP的注射时间至少应在脊髓受损6 h内，但是在MP治疗时间窗内的不同时间点注射MP是否会对持续受压节段脊髓神经细胞凋亡产生不同影响亦需要实验验证。大剂量MP虽然可以减少持续受压节段脊髓神经细胞的凋亡，但不能阻止脊髓神经功能受损，脊髓压迫损伤还需早期解除压迫，促进神经功能恢复。

本实验观察到，在脊髓持续受压初期给予大剂量MP冲击治疗不能推迟受压节段神经细胞开始凋亡的时间，但可以减少脊髓持续压迫期间神经细胞的凋亡，抑制凋亡相关蛋白Bax的表达。

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How methylprednisolone affect the apoptosis of nerve cells in the compressed spinal cord: An experimental study

GAO Bo, DONG Ming-yan, YU Yang, GUAN Xin, GAO Ping
1Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China;2Infectious Diseases Department, Health Authority of Jin Zhou, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

DONG Ming-yan. Email: mydong16@163.com

ObjectiveTo investigate the protective function of methylprednisolone on the nerve cells in the continuously compressed spinal cord.MethodsOne hundred and forty-five Japanese white rabbits were enrolled in this experiment. Five of these rabbits were put in the blank group, seventy of them were put in the operation group and the other 70 rabbits were put in the MP treating group. Rabbits in blank group

cervical median incision to bluntly peel off the muscles without compression of spinal cord and then the incisions were sutured. Meanwhile rabbits in both operation group and MP treating group received mild spinal cord compression by setting a flap head screw between C6 and C7 after the neck. The spinal cord decompression was conducted seven days later. After 30 minutes, rabbits in the MP treating group were injected with a large amount of MP through ear border veins, while the rabbits in the operation group only received 0.9% sodium chloride injection. The transmission electron microscope were used to observe the apoptotic bodies at 6 hours, 24 hours, 3 days and 7 days after compression and 3 days, 7 days, and 14 days after decompression, flow cytometry were used to test the rate of apoptosis of spinal cord cells, and immunohistochemistry were used to test the expression of Bax protein related to apoptosis.ResultsThe neuronal apoptosis appeared after six hours' compression in both operation group and MP treating group. The neuronal apoptosis rates in both groups peaked after three day's compression, but the apoptosis rate in MP group was lower than that in the operation group at every time point. The rates of the apoptosis in MP group and operation group became lower after the decompression of spinal cord, and there were significantly statistical differences in neuronal apoptosis rates among those decompression time points.ConclusionMP given at the early stage can reduce the neuronal apoptosis rate when spinal cord compression happens. In conclusion, using the spinal cord decompression along with MP can protect the nerve function of the compressed spinal cord.

methylprednisolone; spinal cord compression; apoptosis

R 651.2

A

2095-5227(2014)11-1147-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.11.01811112

时间：2014-07-23 10:00 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140723.1000.001.html

2014-05-19

辽宁省科技厅基金项目(2013225305)

Supported by the Science and Technology Committee Foundation of Liaoning Province(2013225305)

高博，男，在读硕士。研究方向：骨科脊柱方向。Email: gaobo305@163.com

董明岩，男，硕士，主任医师，教授。Email: mydong16 @163.com