猪殃殃抗双氟磺草胺的生理机制研究

马鹏生

宁夏大学农学院,宁夏银川750000

猪殃殃抗双氟磺草胺的生理机制研究

马鹏生

宁夏大学农学院,宁夏银川750000

本文通过田间试验和室内分析测定，对敏感性猪殃殃（S生物型）和抗性猪殃殃（R生物型）生理指标变化进行了初步研究。试验结果表明：在田间推荐用量上限4.5 g a.i·hm-2双氟磺草胺处理后，R生物型体内的ALS活力表现为先降低后增高趋势，第7 d时达到峰值，是对照的1.4倍。而S生物型体内ALS活力随着处理时间延长也逐渐降低。通过对保护性酶POD、SOD研究结果表明，R生物型喷药后，体内的POD变化呈增高-降低-增高的趋势，第7 d时达到峰值，比对照高16.5 g-1·FW-1，SOD变化趋势则表现为先降低后增高。S生物型在处理后第4 d，体内的POD活性显著下降，7 d时降到最低，而SOD变化则为随着处理时间延长，SOD活性也逐渐降低。综合分析表明，R生物型在受到双氟磺草胺胁迫后，植株能够进行正常生长，靶标酶ALS仍然保持较高的活性，保护性酶POD、SOD持续稳定是对双氟磺草胺产生抗性的主要生理机制。

猪殃殃;双氟磺草胺;ALS活性;保护性酶

猪殃殃（Galium aparine L.）属茜草科一年生或越年生杂草，攀援或蔓生，是黄河以南各省冬小麦、冬油菜田中最重要的恶性杂草之一。双氟磺草胺是美国陶氏益农公司在20世纪90年代中期开发的三唑嘧啶磺酰胺类除草剂，主要用来防治麦田猪殃殃、野油菜、繁缕、播娘蒿、荠菜等阔叶杂草。其作用机理是通过抑制植物中特有的乙酰乳酸合成酶(ALS)从而阻碍植物细胞的分裂与伸长，抑制支链氨基酸的生物合成途径，阻断细胞分裂过程中从G2到M阶段，以及GI到S过渡，达到杀死杂草的目的[1]。近年来根据调查发现，麦田猪殃殃已经对抑制ALS位点的除草剂产生一定的抗药性[2]。彭学岗等[3]在研究猪殃殃抗性过程中发现，北方不同省份猪殃殃对苯磺隆的抗药性有很大的差异。其中抗性程度最高为河南省，抗性倍数达到4.3倍。毛海燕等[4]在生产实践过程中也发现苯磺隆对猪殃殃的防效明显下降的现象，但这些研究都仅仅局限于对磺酰脲类除草剂的抗性上面。有关猪殃殃对磺酰胺类除草剂的抗性问题至今国内还未见报道。因此，本试验通过测定双氟磺草胺处理后的R生物型和S生物型体内靶标酶ALS、主要保护性酶SOD、POD的变化情况，明确其对双氟磺草胺的抗性程度及抗性产生的生理机制，以其为今后如何治理抗性猪殃殃奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1供试材料

1.1.1 供试试剂试验除草剂为5%双氟磺草胺悬浮剂，由美国陶氏益农（中国）有限公司生产。本试验所用的化学及生化试剂见（下表1）。

表1 化学及生化试剂Table1 Chemicals and Biochemicals

1.1.2 供试仪器本试验使用的仪器有恒温水浴振荡器，由金坛市金南仪器制造有限公司生产；高速冷冻离心机(2～16 p)，由德国Sigma公司生产；UV-2201型紫外分光光度计，由上海谱元仪器有限公司生产。

1.1.3 供试材料本试验的猪殃殃均采自于河南省驻马店市麦田。

1.2测定项目与方法

1.2.1 ALS活性测定

1.2.1.1 溶液配制方法

磷酸缓冲液：配制50 mmol·L-1K2HPO4-KH2PO4PH=7.0的缓冲溶液；酶提取液：配制含0.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1TPP，1 mmol·L-1丙酮酸钠PH7.0的磷酸缓冲液；酶溶解液：配制含0.5 mmol·L-1MgCl2的0.1 mol·L-1，20 mmol·L-1丙酮酸钠pH 7.0的磷酸缓冲液。

1.2.1.2 ALS提取方法

参照Fan等[5]方法并稍作改动。准确称量0.5 g的猪殃殃叶片剪碎后立即放入预冷的研钵中，加入少许液氮，5 mL酶液及石英砂，在冰浴上进行持续研磨，当叶片成于匀浆时，倒入事先准备好的离心管中，定容至8 mL，于25000 g 4℃下离心30 min，用移液枪将上清液置于新的试管中，加入(NH4)2SO4晶体，使之饱和度达到50%左右，当溶液沉淀2 h后，于25000 g 4℃下离心20 min，把上清液倒掉，加入8 mL酶溶解液中待测。

1.2.1.3 ALS活性测定方法

首先在10 mL的玻璃试管中加入1 mL酶液，0.1 mL磷酸缓冲液及0.8 mL酶反应液，摇匀后在32℃的恒温水浴锅中进行1 h的暗反应，之后加入0.2 mL 3 mol/L H2SO4让其中止反应，在60℃水浴锅中脱羧10 min，在加入1 mL 5%甲萘酚和1 mL0.5%肌酸显色20 min，随后立即转入到冰浴中冷却1 min，在525 nm波长下进行比色。

1.2.2 过氧化物酶POD活性测定

1.2.2.1 酶液配制与提取

参照李合生等[6]方法并稍作改动，酶提取液配制：配置0.05 mol·L-1愈创木酚溶液；0.05 mol·L-1、pH 5.5的磷酸缓冲液。

酶液的提取：准确称取0.5 g材料，剪碎后放入液氮预冷的研钵中，加入3 mL的磷酸缓冲液进行持续研磨，当状态为匀浆时，将其倒入离心管中。放置4℃条件下，提取1 d，然后于25000 g 4℃下离心20 min

取上清夜即为酶提取液。

1.2.2.2 POD酶活性的测定

POD酶活性测定的反应体系包括：1.0 mL 2%H2O2；1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚溶液；2.9 mL 0.05 mol·L-1、pH 5.5的磷酸缓冲液，0.2 mL酶液，反应体系加入上述酶液之后，在水浴35℃保温3～5 min，在470 nm波长下进行比色，每隔1 min测定1次，记录吸光度值，酶活性单位(u)以每min内A470变化0.01为一个。

1.2.3 抗氧化酶SOD活性测定

1.2.3.1 酶液提取

参照赵世杰等[7]方法并稍作改动，将待测0.5 g材料切碎之后，放入研钵中，加入1 mL提取液和少许石英砂，在冰浴下快速研磨，当成浆时，倒入离心管中，加入4～5 mL提取液，于15000 g，4℃下进行离心15 min，取上清夜为SOD粗提液。

1.2.3.2 SOD酶活性测定反应体系

表2 SOD酶活性测定的反应体系Table 2 SOD activity assay of reaction system

1.2.3.3 SOD活性的测定和计算

反应的步骤如下，首先将空白试管用黑纸包起来，其他反应的试管放置于日光灯15000 LX下进行反应，反应时间为15 min左右。然后以空白试管作为对照，在波长560 nm下，分别测定其他各管的消光度值，SOD活性单位用抑制NBT光化还原的50%作为一个酶活性单位来表示。

1.3数据统计

用EXCEL 2003和DPS 3.01统计软件进行方差分析，结果用3次重复的“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1ALS活性分析

由图1可以看出，在田间推荐剂量上限4.5 g a.i·hm-2处理后，R生物型和S生物型体内的ALS活力变化有明显差异，S生物型经过处理之后ALS活力呈显著降低趋势并均低于对照。到第7 d时，比对照降低29 nmol/mg，比R生物型降低45.1 nmol/mg，这表明S生物型体内的ALS酶受到药剂抑制作用，使合成支链氨基酸的能力下降，从而对植株造成毒害作用。而R生物型喷药后，ALS活力呈先降低后增高趋势，ALS活力前期受到了短暂的抑制，但抑制作用很快解除，以后一直高于对照。在第7 d时，体内ALS活性达到峰值，是对照的1.4倍(见图1)。因此，R生物型在处理后体内靶标酶仍然保持较高的活性，是对双氟磺草胺产生耐性的主要原因之一。

2.2双氟磺草胺对猪殃殃POD活性的影响

过氧化物酶POD主要的作用是清除植物体内的H2O[8]。在田间推荐上限剂量4.5 g a.i·hm-2处理后，R生物型和S生物型体内的POD活性均表现为先增高后降低趋势（见图2），并且前3 d都高于对照。第4 d时，R生物型和S生物型POD活性出现两极分化，R生物型不断增高，7 d时达到峰值，比对照高16.5 g-1·FW-1。S生物型则不断降低，7 d时降到最低，比对照低16 g-1·FW-1，比R生物型低32.5 g-1·FW-1。这表明双氟磺草胺胁迫后，S生物型体内的POD活性逐渐下降，从而降低了清除H2O2的能力，使脂质受到严重的损害，吸水性急剧下降导致植物枯死。然而R生物型体内的POD活性增加，及时清除H2O2，使植物健康生长。

图1 双氟磺草胺对猪殃殃ALS活力的影响Fig.1 Effect of florasulam on ALS activity of Galium aparine L.

图2 双氟磺草胺对猪殃殃POD活性的影响Fig.2 Effect of florasulam on POD activity after spraying Galium aparine L.

2.3双氟磺草胺对猪殃殃SOD活性的影响

在剂量为4.5 g a.i·hm-2处理后，R生物型和S生物型体内的SOD活性差异明显（见图3）。S生物型在喷药后，随着处理时间延长，SOD活性也逐渐降低，到第7 d时达到最低，比R生物型低290.7 U·g-1·FW-1，比CK低309.5 U·g-1·FW-1。而R生物型SOD活性在喷施双氟磺草胺后，前3 d表现为降低趋势，从第4 d开始增高，到6 d时基本恢复到同期对照水平。这表明R生物型在胁迫后，体内的SOD活性逐渐增加，解除了超氧自由基的毒害作用，这可能是对双氟磺草胺产生抗性的另一个原因。

图3 双氟磺草胺对猪殃殃SOD活性的影响Fig.3 Effect of florasulam on SOD activity of Galium aparine L.

3 讨论

通过上述研究表明，河南驻马店地区麦田猪殃殃已经对双氟磺草胺产生了一定的抗性，即使田间推荐上限用量也不能达到很好的防效，而有调查研究发现，双氟磺草胺已经在该地区连续单一用药10余年之久，长期单一用药增加了对猪殃殃的选择压力，从而产生抗性单体，并逐渐形成抗性种群[9,10]。

通过对性猪殃殃生理指标研究中发现，在双氟磺草胺胁迫下，R生物型和S生物型体内的ALS活力变化明显，S生物型ALS活力随着时间延长呈显著性降低趋势，这表明ALS活力酶受到抑制，使之合成支链氨基酸的能力降低，造成蛋白质合成紊乱而死亡[11]，这与隋标峰等[12]研究麦田抗性杂草在苯磺隆处理后，乙酰乳酸合成酶的活性一直增加的结果是一致的。另外，有文献报道ALS基因突变或过量表达是杂草对除草剂敏感性降低的主要分子机制[13]。关于本文所研究的R型猪殃殃抗性分子机制需要在今后通过分子检测手段来确定。

从生理指标POD、SOD酶的活性研究发现，在双氟磺草胺胁迫下，S生物型体内的保护酶POD、SOD活性不断降低，然而R生物型体内的POD活性则高于对照，SOD活性变化与对照基本无差异。这表明POD活性随着处理时间延长而不断上升，可能是为了维持自身的代谢，而对双氟磺草胺产生的一种保护机制[14,15]。另外，本文仅研究了猪殃殃在受到双氟磺草胺胁迫后，植物体内的靶标酶ALS、超氧化物歧化酶SOD、过氧化清酶POD的变化情况，没有对解毒代谢酶GSTs、P450的变化进行深入分析，也没有涉及到猪殃殃对双氟磺草胺的吸收传导，需要在未来做更进一步研究。

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Study on the Physiological Mechanism of the Resistance of Galium aparine L.against Florasulam

MA Peng-sheng
School of Agriculture Ningxia University,Yinchuan,750000,China

This paper preliminarily studied the physiological symptom change of sensitiveGalium aparineL.(S biotype)and resistantGalium aparineL.(R biotype)through field test and analysis measure in laboratory.The results showed that:the ALS dynamic performance in R biological increased first then decreased after sulfur difluoride alachlor treatment in the field recommended dosage limit 4.5 g a.i hm-2,and reached a peak at 7 d,which is 1.4 times of references.While in S biological, the ALS dynamic performance gradually reduce with the prolong of processing time.Results through the study on protective enzyme POD and SOD showed that POD changes in R biotype after spraying was increasing,reducing and increasing and reach a peak at 7 d,which is 16.5 g-1·FW-1higher than the reference.SOD changing trend was decreasing first then increasing.S biotype at 4 d after processed.POD activity in the body was significantly decreased after treatment and reached a minimum at 7 d.SOD changes prolonged with the prolonging processing time and SOD activity was also decreased. Comprehensive analysis showed that the plants of R bio-type can normally grow after being stressed by double fluoride sulfur alachlor and neuropathy target esterase ALS remained high activity,the sustained and steady protective enzymes POD, SOD was the main physiological mechanism producing anti-sulfonamide to Florasulam.

Galium aparineL.;Florasulam;ALS activity;protective enzymes

TQ450.1+3

A

1000-2324(2014)05-0778-04

2013-04-20

2013-05-12

马鹏生(1979-),男,汉族,甘肃省静宁县人,讲师,研究方向:天然药物药理学