神经纤毛蛋白1、2在大肠癌组织中的表达及意义

徐卫国苗 娜孙 红刘 云张世伟郝小惠

神经纤毛蛋白1、2在大肠癌组织中的表达及意义

徐卫国1苗 娜1孙 红2刘 云1张世伟1郝小惠3

目的 探讨神经纤毛蛋白（NRP）-1、2在大肠癌组织中的表达及其与微血管密度（MVD）的相关性，以揭示NRP-1、2与肿瘤血管生成的关系。方法采用免疫组织化学方法检测66例大肠癌患者的癌组织、癌旁组织及正常组织中NRP-1、2的表达情况，以CD105标记肿瘤新生血管内皮细胞，计数MVD值。结果（1）NRP-1、NRP-2在大肠癌组织、癌旁组织、正常组织中的表达阳性率分别为71.2％、25.8％、0，及80.3％、15.2％、0，各组间比较差异有统计学意义(P＜0.01)。（2）MVD在大肠癌组织、癌旁组织及正常组织中的计数分别为35.682±5.542、14.485±3.301、6.864±1.771，各组相比差异有统计学意义（F=986.654，P＜0.01）。（3）不同年龄、性别、肿瘤的部位及分化程度的患者NRP-1、2的表达差异无统计学意义。肿瘤＞5 cm的患者NRP-1阳性表达率较高，肿瘤侵及浆膜及以外、有淋巴结转移的患者NRP-1、2的阳性表达率均较高，不同的Dukes分期患者NRP-1、2阳性表达差异亦有统计学意义（P＜0.05）。（4）大肠癌患者不同性别、年龄及肿瘤大小、部位和组织分化程度MVD的表达差异无统计学意义，而浸润到浆膜及以外、有淋巴结转移、Dukes分期高的患者相关MVD的表达增加(P＜0.01)。（5）大肠癌组织中NRP-1（r=0.599，P＜0.01）、NRP-2（r=0.484，P＜0.01）的表达与MVD计数均呈正相关关系。结论NRP-1、2在大肠癌的血管新生中起重要作用，并且与大肠癌侵袭和转移关系密切。

结直肠肿瘤；神经纤毛蛋白质类；免疫组织化学；大肠癌；微血管密度；肿瘤血管生成；血管内皮细胞

大肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病率居高不下，而治疗多以手术为主[1]。神经纤毛蛋白(Neuropilins,NRPs)为一种非酪氨酸依赖性激酶，是Ⅲ型Sema分子与血管内皮生长因子(VEGF)家族分子共享的一类跨膜非信号传导受体。其家族包括两个成员即NRP-1和NRP-2，其中NRP-1主要表达在动脉内皮细胞，在肿瘤血管的新生及肿瘤的浸润和转移中发挥重要作用[2]，而NRP-2主要表达在静脉及淋巴管内皮细胞，可能与肿瘤淋巴管新生及淋巴结转移关系密切[3]。本研究前期发现，NRP-1 mRNA表达水平与大肠癌组织的微血管密度(MVD)呈正相关[4]。本文旨在探讨NRP-1和NRP-2在大肠癌发生、发展中的作用，及其与临床病理特征的联系和血管转移的相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河北联合大学附属医院2011年11月—2013年2月手术切除并经病理证实的大肠癌标本66例，包括癌组织、癌旁组织及正常组织。其中男39例，女27例；年龄40～87岁，平均年龄63.5岁，其中≤50岁者11例，＞50岁者55例。所有病例术前均未接受化疗、放疗、免疫治疗及中医中药治疗。

1.2 临床病理特征 66例大肠癌病例中，原发肿瘤直径≤5 cm者30例，＞5 cm者36例；肿瘤位于结肠者45例，位于直肠者21例；肿瘤侵及浆膜以内者14例，侵及浆膜及浆膜外者52例；病理分级：高分化癌24例，中低分化癌42例；有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者30例；肿瘤分期采用Dukes分期标准：A期+B期30例，C期+D期36例。

1.3 试剂来源及实验方法 SP免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥公司，二氨基联苯胺（DAB）显色剂及CD105抗体购于北京中杉金桥公司，兔抗人NRP-1蛋白多克隆抗体购于Epitmics公司，鼠抗人NRP-2蛋白多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。常规石蜡包埋，4 μm连续切片，采用免疫组化染色法检测NRP-1、2。CD105免疫组化染色，于光镜100倍视野下寻找微血管分布均匀区域，后在200倍（每个视野面积为0.785 mm2）视野下选取与周围肿瘤和结缔组织成份区别明显的棕黄染色的内皮细胞或细胞丛作为一个血管计数。记录5个视野内的微血管数，取其平均数作为该病例的MVD值[5]。

1.4 染色结果评定 NRP-1、2以肿瘤细胞的胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒定义为阳性结果，采用细胞阳性百分率和细胞染色强度得分之和进行其表达的评定[6-7]。每张切片在高倍镜下随机读取5个视野（×400）。（1）阳性细胞数＜5％为0分，5％～为1分，25％～为2分，＞50％为3分。（2）无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将上述两项相加，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中等阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理。计数资料以例（％）表示，采用χ2检验；计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用Dunnett’s T3法。NRP-1、2的表达评分和MVD值的相关性分析采用Pearson相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌组织中NRP-1、2的表达及与临床病理参数的关系 NRP-1、NRP-2在大肠癌组织中可表达于肿瘤细胞胞质和胞膜，亦可分别表达于组织中动脉的内皮细胞或淋巴管内皮细胞（不定义为阳性结果），呈淡黄至棕黄色颗粒状，见图1。66例大肠癌组织中NRP-1阳性表达者为47例（71.2％），癌旁组织阳性表达者为17例（25.8％），正常组织为0例。癌组织中NRP-2阳性表达者为53例（80.3％）；癌旁组织阳性表达者为10例（15.2％），正常组织为0例，NRP-1、2在癌组织的阳性表达率明显高于其癌旁组织及正常组织的阳性表达率，差异有统计学意义（χ2分别为78.452和110.768，均P＜0.01）。不同年龄、性别、肿瘤的部位及分化程度的患者NRP-1、2的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤＞5 cm的患者NRP-1阳性表达率较高，肿瘤侵及浆膜及以外、有淋巴结转移的患者NRP-1、2的阳性表达率均较高，Dukes分期高的患者NRP-1、2阳性表达增加,差异亦有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），见表1。

2.2 MVD计数与临床病理参数的关系 根据CD105的表达情况，计数大肠癌组织的MVD值，66例患者大肠癌组织中MVD值为35.682±5.542，明显高于癌旁组织的 14.485±3.301和正常组织的6.864±1.771(F=986.654，P＜0.05)。大肠癌患者不同性别、年龄及肿瘤大小、部位、组织分化程度MVD的表达差异无统计学意义（P＞0.05），而浸润到浆膜及以外、有淋巴结转移、Dukes分期高的患者相关MVD的表达增加(P＜0.01)，NRP-1阳性表达的大肠癌组织MVD值为36.872±5.648，高于NRP-1阴性表达的32.737±4.067，差异有统计学意义（t=2.897，P＜0.05）。NRP-2阳性表达的大肠癌组织MVD值为36.396±5.134，高于NRP-2阴性表达的32.796± 6.379，差异也有统计学意义（t=2.174，P＜0.05）,见表1、图2。

2.3 MVD计数与NRP-1、NRP-2表达间的相关性分析 大肠癌组织中NRP-1的表达评分与MVD值呈正相关关系（r=0.599，P＜0.01），NRP-2的表达评分与MVD值呈正相关关系（r=0.484，P＜0.01），NRP-1、NRP-2均与大肠癌组织血管新生有关。

Tab.1 Expression of NRP-1,2 in colorectal cancer tissue and correlation of MVD value with its the clinical features and pathological parameters表1 大肠癌组织NRP-1、2的阳性表达及MVD值与临床特征和病理参数的关系

3 讨论

目前认为恶性肿瘤的发生、发展均依赖于肿瘤组织新生血管的形成，为肿瘤的生长提供所需的氧和营养物质，亦是肿瘤细胞浸润转移的重要因素。本文主要从蛋白表达水平探讨NRP-1、NRP-2与大肠癌组织新生血管及浸润转移的关系，结果显示大肠癌组织中，NRP-1、NRP-2的蛋白表达水平随着MVD值的升高而增加，两者呈正相关关系，并且NRP-1、NRP-2的表达与大肠癌的浸润深度、淋巴结转移及Dukes分期有关，因此，NRPs与大肠癌组织血管新生密切相关，还可促进癌组织的侵袭及转移。

NRPs是一种多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可与VEGF相互作用既可抑制肿瘤细胞的凋亡，又可调节肿瘤血管的生成。最初认为NRPs只表达于神经元细胞，近来发现在乳腺癌细胞[8]、胰腺癌细胞[9]中也有NRPs的表达。NRP-1和NRP-2在肺癌患者中过表达。NRP-1的过表达可促使内皮细胞的分裂、增殖及转移，诱使肿瘤血管的增殖，对肿瘤的生长、迁徙及肿瘤血管的生成起促进作用。NRP-2也可促进肿瘤细胞的远处转移。Xu等[10]发现肝癌小鼠肝癌细胞NRP-1的表达与MVD呈正相关，提示NRP-1与肿瘤血管生成有关，而抑制NRP-1的表达可以抑制体内外肝癌细胞的生长。本课题组前期研究发现，NRP-1、NRP-2的表达程度与大肠癌淋巴结转移有关[11-12]。因此，可针对NRPs的表达对大肠癌患者进行治疗。Dhar等[13]通过小鼠实验发现肿瘤细胞中的血小板生成因子(PDGF-B)-NRP-1信号系统可以通过骨髓间充质细胞促进肿瘤血管的新生以及肿瘤的生长和转移，因此可以针对NRP-1进行肿瘤抗血管靶向治疗。近来有研究发现，NRP-2也与MVD值密切相关，可促进恶性黑色素瘤的血管新生、发展及转移[14]。NRP-2还可增加血管和淋巴管内皮细胞的生长和迁移，在肿瘤生长方面起重要作用。鉴于NRP-2在肿瘤细胞迁移和浸润方面的作用，针对NRP-2可提供一个潜在的新方法去抑制胃肠道转移癌患者癌细胞的生长和存活[15]。Stanton等[16]研究发现NRP-2也可成为癌症治疗的一个新靶点。

本研究结果表明，NRP-1和NRP-2的过表达与大肠癌的发展及浸润转移密切相关。NRP-1和NRP-2的表达与MVD呈正相关关系，提示NRPs可能参与了肿瘤血管的新生。近年来，NRP-1、NRP-2已成为抗肿瘤血管形成方法治疗肿瘤的重要靶点，但患者是否从此类制剂中获益，及此疗法的有效性还有待于进一步研究。

Fig.1 Expression of NRP-1 and NRP-2 in colorectal carcinoma,paraneoplastic tissues and normal tissues(×400)图1 NRP-1和NRP-2在大肠癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达（×400）

Fig.2 Expression of CD105 in NRP-1,2 positive and NRP-1,2 negative colorectal carcinoma(×200)图2 NRP-1、2阳性和NRP-1、2阴性大肠癌组织中CD105的表达（×200）

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（2013-12-16收稿 2014-06-02修回）

（本文编辑 魏杰）

Expression and Clinical Significance of Neuropilin-1 and 2 in Colorectal Carcinoma

XU Weiguo1，MIAO Na1,SUN Hong2,LIU Yun1,ZHANG Shiwei1,HAO Xiaohui3
1Department of Surgical Oncology,the Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan 063000,China；2Department of Pathology,School of Basci Medicine,Hebei Union University,3Experimental Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo observe the expression of Neuropilin(NRP)-1,2,to calculate micro vessel density(MVD) in colorectal cancer,paraneoplastic tissues,normal tissues,and to investigate the correlation between NRP-1,2 and MVD to understand the role of NRP-1,2 in the process of tumor angiogenesis.MethodsExpression of NRP-1 and NRP-2 were studied by immunohistochemistry in 66 specimens from colorectal cancer,paraneoplastic tissues and normal tissues.MVD was assessed based on CD105 immunohistochical staining.Results(1)The positive expression of NRP-1,2 in colorectal cancer,paraneoplastic tissues,normal tissues were 71.2％,25.8％,0;80.3％,15.2％,0 respectively.There was a statistical difference between them(P＜0.05).(2)The quantity of MVD in colorectal cancer,paraneoplastic tissues and normal tissues were 35.682±5.542,14.485±3.301 and 6.864±1.771 respectively.There was a statistical difference between them(P＜0.05). (3)Expression of NRP-1,2 had a good correlation with the tumor size,infiltrating depth,lymph node metastasis,Dukes staging(P＜0.05),but no correlation was found with the tumor position,histological types,differentiation degree and the gender or age of patients(P＞0.05).(4)The MVD value had no correlation with the gender or age of patients,tumor size,position, histological types(P＞0.05),but had a good correlation with infiltrating depth,lymphatic metastasis and Dukes staging(P＜0.05).(5)There was a positive correlation between NRP-1,2 and MVD value(P＜0.01).ConclusionNRP-1,2 may play an important role in the angiogenesis of the colorectal cancer,and it correlates with the invasion and metastasis of colorectal cancer closely.

colorectal neoplasms;neuropilins;immunohistochemistry;colorectal cancer;micro vessel density；tumor angiogenesis;vascular endothelial cell

R735.3+4

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.011

河北省科技厅资助项目（10276115D）

1河北联合大学附属医院肿瘤科（邮编063000）；2河北联合大学基础医学院病理学系;3河北联合大学实验研究中心