高效液相色谱法测定动物性食品中二氯二甲吡啶酚的不确定度评定

2014-07-03冯修光李桂华尹伶灵薄永恒

山东畜牧兽医 2014年1期

关键词：二氯吡啶容量瓶

陈玲① 冯修光① 李桂华② 尹伶灵① 薄永恒①

（①山东省兽药质量检验所济南 250022 ②山东省饲料质量检验所）

试验研究

高效液相色谱法测定动物性食品中二氯二甲吡啶酚的不确定度评定

陈玲① 冯修光① 李桂华② 尹伶灵① 薄永恒①

（①山东省兽药质量检验所济南 250022 ②山东省饲料质量检验所）

运用测量不确定度的基本方法和程序，建立高效液相色谱法测定鸡肝中二氯二甲吡啶酚残留量的测量不确定度评定的数学模型，对测量过程中的不确定因素来源进行分析和量化计算，得出高效液相色谱法测定鸡肝中二氯二甲吡啶酚残留量不确定度结果，当求得鸡肝中二氯二甲吡啶酚的残留量为78.0μg/kg 时，扩展不确定度为3.5μg/kg。

测量不确定度高效液相色谱法二氯二甲吡啶酚

氯羟吡啶是一种光谱抗球虫药，毒性小，对鸡、兔的球虫病均有较好效果。在国内养殖业应用广泛。但是一些禽养殖场经常发生不合理用药和滥用药的情况，且不按规定执行休药期，这一类动物源性食品被人类长期食用会出现蓄积中毒，我国对该类药物在动物组织中的最高残留限量做出了严格的规定。本文对测定鸡肝中二氯二甲吡啶酚含量的不确定度来源进行分析，并对测量不确定度进行评定。

1 材料与方法

1.1 方法提要用甲醇提取试样中二氯二甲吡啶酚，经氧化铝柱、阴离子交换柱净化，用带紫外检测器的液相色谱仪测定二氯二甲吡啶酚残留量，外标法定量。

1.3 前处理过程测定方法参考SN/T0212.1- 1993标准方法，称取约5g(精确至0.01g)试样和5g无水硫酸钠于50ml离心管中，加入甲醇8ml，涡旋混合提取1min，静置0.5h，以4000r/min离心10nin。将上清液过氧化铝柱和阴离子交换柱净化，滤渣加甲醇涡旋，离心，过柱共2次，用甲醇8ml/次，待提取液全部通过氧化铝柱后，用8ml甲醇淋洗两柱，至此，弃去全部淋洗液，取下氧化铝柱，将25ml容量瓶置于阴离子交换柱下，用0.5%乙酸甲醇溶液洗脱二氯二甲吡啶酚，洗脱液接至刻度，摇匀.自容量瓶中准确移取5ml洗脱液至10ml玻璃离心管中，于60的水浴中，缓慢用氮气吹干，以0.50ml甲醇溶解残渣，过0.45m有机系滤膜后供高效液相色谱分析。

2 被测量的数学模型

3 不确定度的来源

从测量过程和确定的数学模型分析，测量不确定度主要来源于以下几个方面：（1）样品称量产生的不确定度；（2）样品提取过程中产生的不确定度；（3）样品洗脱液定容体积产生的不确定度；（4）样品洗脱液取样体积产生的不确定度；（5）样品测试液定容体积产生的不确定度；（6）测定样品测试液中二氯二甲吡啶酚浓度产生的不确定度。

4 测量不确定度的评定

4.1 样品称量产生的标准不确定度

4.1.1 天平校准产生的标准不确定度u1(m) 天平检定证书给出天平的线性分量是±0.0001g，线性分量被假设为矩形分布，换算成标准不确定度为u1(m)＝0.0001g/ 1.732=0.00006g。

4.1.2 重复称量产生的标准不确定度u2(m) 本次验证做了5个平行样，对5号样品进行6次重复称量，称量结果分别为：0.5009、0.5010、0.5010、0.5008、0.5009、0.5011g。其平均值m= 0.5010g，标准偏差s(m)=0.0001g，按A类评定重复称量样品引起的标准不确定度，则：u2(m)＝s(m)/2.449＝0.000041g，将u1(m)、u2(m)进行合成，则样品称量产生的标准不确定度为：相对标准不确定度为：

4.2 样品测试液定容体积产生的标准不确定度

使用GILSON G系列单道微量固定移液器一支，仪器商给出技术参数：精度等级±0.6%，加甲醇0.500ml，即0.003ml。假设矩形分布，标准不确定度为：u(V1)＝0.003/1.732＝0.0018ml；相对标准不确定度为：u(V1)/V1＝0.0018/0.500＝0.0036。

4.3 样品洗脱液定容体积产生的不确定度

4.3.1 容量瓶校准产生的标准不确定度u1(V3) 依据JJG-196-1990“常用玻璃量器检定规程”，A级25ml容量瓶的最大允许误差为±0.03ml，按三角分布考虑，k=2.449则，u1(V1)=0.03/2.449=0.012 ml

4.3.2 溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度

u2(V3) 假设溶液温度与校准温度的差异为±5℃，容量瓶的体积V1=25ml，0.5%醋酸甲醇的膨胀系数近似采用水的膨胀系数α=2.1X10-4℃-1(玻璃的膨胀系数太小α=1.5X10-5℃-1，忽略不计)，按矩形分布考虑，k=1.732则：u2(V3)＝V3× α×5/k＝0.015ml。

4.3.3 25ml容量瓶刻度观察变动性u3(V3) 根据多次试验统计，u3(V3)＝0.010ml。将标准不确定度分量u1(V3)，u2(V3)，u3(V3)进行合成，则样品从阴离子柱洗脱后定容到25ml容量瓶中产生的标准不确定度为：u(V3)25ml容量瓶中产生的相对标准不确定度为：u(V3)/V3＝0.021/25＝0.00084。

4.4 样品洗脱液取样体积产生的标准不确定度

5.00ml移液管的最大允许误差为±0.015ml，用5.00ml移液管移取样品消解液产生的标准不确定度为：u(V2)=0.0070ml；5.00ml移液管移取样品消解液产生的相对标准不确定度为：u(V3)/V3＝0.0070/5＝0.0014

4.5 测定样品测试液中的二氯二甲吡啶酚浓度产生的标准不确定度

4.5.1 二氯二甲吡啶酚标准储备液配制产生的标准不确定度u(Cs) （1）二氯二甲吡啶酚标准储备液称量产生的标准不确定度u(Cc)。①天平校准产生的标准不确定度u1(Cc)。天平检定证书给出天平的线性分量是±0.01mg，线性分量被假设为正态分布，换算成标准不确定度为：u1(Cc)＝0.01mg/1.96=0.00510mg。②重复称量产生的标准不确定度u2(Cc)。标准品用称量壶重复称量6次(0.02226、0.02225、0.02228、0.02227、0.02226、0.02224/g)，标准偏差为s＝0.01414mg，按A类评定重复称量样品引起的标准不确定度为u2(Cc)＝s/2.449＝0.00578mg。③标准品纯度引起的标准不确定度u3(Cc)。标准品证书给出的纯度为98.5%±0.5%，即0.985±0.005按均匀分布转换成标准不确相对标准不确定度为：u(Cc)/m＝0.00823/22.26＝0.00037。（2）二氯二甲吡啶酚标准储备液稀释产生的标准不确定度u(V100)。将标准品用甲醇溶解并定容到200ml容量瓶，得Cs＝100µg/ml的二氯二甲吡啶酚标准储备液。200ml单标线容量瓶的最大允许误差为±0.13ml，按3.3的评定方法进行评定，甲醇的膨胀系数近似采用水的膨胀系数α=2.1X10-4℃-1，则用200ml容量瓶定容产生的标准不确定度为：u(V100)＝0.133ml，相对标准不确定度为：u(V100)/V100＝0.00067。稀释过程c＝m/v，所以u(Cs)/Cs＝[u(V100)/V100]2+[u(Cc)/ m]2＝0.00076，u(Cs)＝0.076µg/ml。

4.5.2 由二氯二甲吡啶酚标准储备液配制成二氯二甲吡啶酚标准工作溶液产生的标准不确定度用10ml移液管移取10.00ml二氯二甲吡啶酚标准储备液并定容到100ml容量瓶，得10µg/ml的二氯二甲吡啶酚标准中间液。分别精密量取1.00、1.00、2.00、5.00、5.00、10.00ml至200、100、100、100、50、50ml容量瓶中并定容，配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0µg/ml的系列溶液。按3.3的评定方法进行评定，甲醇的膨胀系数近似采用水的膨胀系数α=2.1X10-4℃-1，各不确定度分量互不相关，合成得各浓度标准工作溶液稀释过程中的相对标准不确定度，见表1。定度为u3(Cc)=0.005/1.732 =0.00289mg。将上述独立因素的不确定度 u1(Cc)、u2(Cc)、u3(Cc)进行合成，则二氯二甲吡啶酚标准储备液称量产生的标准不确定度为：u(Cc)

表1 相对标准不确定度 (mg/ml、ml)

所以此项最大相对标准不确定度u(V玻仪)/V玻仪＝0.0032。

4.5.3 5份样品重复测量产生的相对标准不确定度u1(C0)对每份样品测试液进行2次重复测定，进行不确定度A类评定，结果列于表2。

4.5.4 标准工作曲线求CO时产生的标准不确定度二氯二甲吡啶酚系列标准工作溶液的色谱峰面积I与浓度，结果列于表3：

利用表2中的数据，使用线性最小二乘法拟合标准工作曲线，得线性回归方程I=aCX+b，相关系数r=0.99998，斜率a=66300ml/μg，截距b=462。

表2 各浓度单位不确定度A类评定 (μg/ml)

表3 标准曲线求C0产生的不确定度 (μg/ml)

由标准工作曲线求CO时产生的标准不确定度u2(CO)按下式计算：

式中：u2(CO)—绘制标准工作的曲线求CO时产生的标准不确定度(μg/ml)；S—也称标准曲线残差；a、b—分别表示标准工作曲线的斜率(ml/μg)、截距；P—样品测试液的测定次数；n—标准工作溶液的测定次数；CO—样品测试液中二氯二甲吡啶酚的浓度(μg/ml)；Ci，Ii—分别为系列标准工作溶液对应的二氯二甲吡啶酚浓度(μg/ml)和峰面积值。将有关数据P=2，n=18，C=0.7035μg/ml，CO(见表1)，代入得标准曲线残差S＝359.27，标准工作曲线产生的标准不确定度见表4。