两种线栓制备法制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注损伤模型的研究

田莹，刘艺，余化霖

(昆明医科大学第一附属医院护理部1、神经外科二科2，云南昆明 650032)

·论著·

两种线栓制备法制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注损伤模型的研究

田莹1，刘艺2，余化霖2

(昆明医科大学第一附属医院护理部1、神经外科二科2，云南昆明 650032)

目的评价两种制备线栓的方法，为脑缺血实验研究提供稳定可靠的动物模型。方法30只SD雄性大鼠(250～280 g)随机分成两组各15只，第一组采用Zea Longa流派(线栓头端加热成球形)，第二组采用Koizumi流派(线栓头端用胶包裹)，两种线栓制备法分别制作大鼠大脑中动脉阻塞再灌注损伤模型，观察手术时间、神经功能评分，计算梗死百分比，并分析神经功能评分和脑梗死体积比之间的关系，对两种线栓制备法模型的成功率与稳定性进行评价。结果两组在神经功能评分、脑梗死体积比差异无统计学意义(P＞0.05)；两组模型的稳定性相近；神经功能评分与脑梗死体积比之间存在相同变化趋势；第二组操作时间少于第一组，两组之间的差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论第二组的线栓制备法线栓头采用密封胶包裹，线栓头大小容易控制，较第一组线栓头端加热成球形所需时间短，且易操作。

中动脉阻塞再灌注；模型；线栓法；大鼠

随着当今社会的老龄化，脑血管的发病率日益增加，大鼠大脑中动脉阻塞再灌注损伤模型(MCAO/R)已经被广泛应用于急性局灶性脑梗死的研究。在整个模型制作过程中，线栓的制作尤为重要。目前对线栓的材质及其制备并无统一的标准，本研究旨在寻找合适可用、操作性重复性强的线栓并将其与传统线栓做对比研究，探索简便易行、稳定性好的建模方法，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物成年雄性SD(Sprague-Dewley)大鼠30只，体重250～280 g，由昆明医学院动物研究中心提供，饲养温度18℃～22℃，随机分成两组，每组15只。

1.2 材料“极波”牌渔线(兴化市渔乐渔具厂)、快干型防霉硅酮密封胶、10%水合氯醛、2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)、10%多聚甲醛等；生理盐水配制2%的TTC染色，染液，避光保存。

1.3 模型制作

1.3.1 动物的处理及线栓的制备参照Longa等[1]和罗勇等[2]报道的方法，采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性脑缺血再灌注模型。30只SD大鼠随机分成两组，第一组采用Zea Longa等[3]流派传统的制作线栓法，在线栓前端加热烫成一光滑而膨大的球形术中使用；第二组采用Koizumi等[4]流派的方法，在线栓头端用快干型密封胶包裹形成类梭形术中使用。两组均选用直径0.23～0.26 mm渔线。每组保证15只完成。

1.3.2 手术步骤大鼠经10%水合氯醛4 ml/kg腹腔内麻醉后仰卧固定于手术台上，取颈部旁正中切口3～5 cm，剪开皮肤，逐层钝性分离皮下组织及筋膜，见到颈总动脉(Common carotid artery，CCA)鞘后充分暴露术野；将CCA、颈内动脉(Internal carotid artery，ICA)、颈外动脉(External carotid artery，ECA)及相邻神经分离出来后尽量把ICA入颅前唯一的分支——翼腭动脉(Pterygopalatine artery，PPA)分离露出根部，在ECA近CCA分叉处将其结扎，CCA近心端也结扎，此结扎处与CCA分叉间备线。微型血管夹暂时夹闭ICA，在CCA结扎处与备线处间斜行剪一小口，眼科镊挑起破口后插入线栓。插线前可将线栓制成微向上向右的弧形以顺应血管的生理弯曲，进线深度至CCA分叉处1.8～2.0 cm时线栓进入大脑前动脉(Anterior cerebral artery，ACA)并堵住大脑中动脉(Middle cerebral artery，MCA)入口，阻断了同侧ICA和经ACA来自对侧ICA的血供，结扎备线略作固定，依次缝合皮肌各层，栓线外留1 cm有颜色标记的尾端，上述过程一般30～40 min。记录穿线成功的时间点(不包括缝皮的时间)，术后回笼，单笼饲养，笼内保暖。

1.3.3 再灌注栓线植入2 h后再次麻醉，由露出皮肤的栓线尾部将栓线缓缓抽出，当栓线球面前端遇到CCA结扎线时感觉有阻力，即停止拔线，剪除栓线的残余末端，大鼠清醒后可自由进食、进水。

1.4 观察指标

1.4.1 神经功能评分神经行为功能测试：评分参照Bederson等[5]、Zea longa等[3]的五级4分评分方法并改进。0分(0级)：未见神经病学征象；1分(Ⅰ级)：轻微的神经功能缺损；2分(Ⅱ级)：中度局灶性神经功能缺损；3分(Ⅲ级)：重度局灶性神经功能缺损；4分(Ⅳ级)：无自发活动及意识水平下降。0级、Ⅳ级为模型失败，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级为模型成功，以Ⅱ级、Ⅲ级占成功模型的百分率来评价模型稳定性[6]。待麻醉醒后2 h进行第一次神经功能评分，再灌注6 h、24 h分别再进行两次神经功能评分。

1.4.2 脑梗死体积测定大鼠缺血再灌注24 h候麻醉后处死取脑，-20℃冰箱中速冻20 min。在冰盘上取前脑切片，切四刀，成5～6片脑片，每片厚约2 mm，由额级开始从前至后依次排序。切片置于2% TTC中，放入37℃温箱15～30 min，翻动脑片染色，脑片中正常组织为红色，梗死组织为白色。30 min后将脑片移出置入10%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱固定24 h。脑片固定后用数码相机照相，输入计算机，经电脑图像分析量化脑梗死绝对体积占对侧大脑半球体积的百分比，用梗死率(Infarction ratio)表示梗死灶的大小，将所得值用于统计学处理。

1.5 统计学方法收集整理实验组数据，应用SPSS11.5统计分析软件包进行处理；各组均数以均数±标准差(±s)表示，两组间差异用独立样本t检验或方差分析，检验水准α=0.05，组内比较用变异系数。

2 结果

2.1 手术评估第一组动物模型制作手术操作时间为(39.4±5.50)min；第二组为(30.30±9.28)min。实验结果表明，第二组操作时间少于第一组，与第一组比较差异有统计学意义(P＜0.01)；动物模型制作成功率第一组(60%)与第二组(73%)比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 动物模型的神经功能评分比较采用Wilcoxon秩和检验分析，结果显示大鼠模型在麻醉后2 h、再灌注6 h、再灌注24 h三个时间点的神经行为功能评分在第一组和第二组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 两组动物模型神经功能评分(±s，分)

表1 两组动物模型神经功能评分(±s，分)

组别第一组第二组Z值P值麻醉后2 h 1.00±4.00 4.00±1.00 -0.682 0.495再灌注6 h 0.73±0.88 3.00±1.00 -0.938 0.348再灌注24 h 1.00±1.00 2.00±2.00 -0.910 0.363

2.3 动物模型稳定性比较第一组动物模型神经行为功能评分测试Ⅱ～Ⅲ级5例，其他级别10例，计算此组模型稳定性为33.3%；第二组测试Ⅱ～Ⅲ级8例，其他级别8例，此组模型稳定性为53.3%。经过χ2检验结果显示，第一组和第二组模型制作成功稳定性差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 脑梗死体积测定根据照片分组计算两组30只大鼠全部鼠脑标本不同片层的每片脑片的梗死体积比，梗死面积比=梗死面积/总面积。分组计算两组30只大鼠全部鼠脑标本不同片层的脑片的平均梗死面积比值(图1)。第一组动物模型15只大鼠脑梗死体积比为(21.89±0.71)%，第二组大鼠脑梗死体积比为(22.75±3.32)%，采用Wilcoxon秩和检验分析，结果显示第一组和第二组脑梗死体积比差异无统计学意义(P＞0.05)。观察发现，大鼠神经功能缺失评分高低与脑梗死体积比的大小呈相同变化趋势，神经功能缺失评分高的大鼠，其脑梗死体积比也大。

图1 两组大鼠脑梗死体积比比较

3 讨论

3.1 大鼠体重与栓线直径、栓线头直径有学者认为大鼠体重越重，插线直径越大[7]，本实验选择大鼠体重为250～280 g，笔者认为该体重的大鼠，血管变异性小，生命耐受力强，易于控制实验条件；线栓直径选择为0.23～0.26 mm的线栓，栓线过粗不能进入颅内，过细在颅内插入太深，会导致蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)大鼠死亡。根据本实验大鼠体重，我们制作线栓头直径应用的两种方法直径均控制在0.28～0.30 mm。此外要注意拴线的质量，一些质地脚软的线不宜选择，否则增加插线难度，质地太硬易造成血管损伤。

3.2 线栓头及线栓的处理在模型制作过程中，对线栓头端的处理是为了让阻断更加彻底、可靠，同时减少对血管壁的机械性损伤。线栓头端光滑与否对其插入是否顺畅及造成的缺血性损伤的稳定性有较大影响，本实验第一组在线栓前端加热烫成一光滑而膨大的球形；第二组在线栓头端用快干型密封胶包裹形成类梭形。两组线栓头制作均严格要求光滑度，并对线栓头直径作了严格要求，处理均按上述要求完成。值得一提的是，第二组用密封胶涂覆梭形头线栓的制备方法，制作简便，涂敷效果理想，密封胶化学性质稳定，不刺激血管，不与血液成分发生反应，处理后的线栓头端圆顿，不易损伤血管壁，在推送栓线过程中更为顺畅，实验结果表明，第二组操作时间少于第一组，两组比较差异具有统计学意义。第二组较第一组易操作，线栓头端大小更易控制。

3.3 栓线插入深度插入过程中，强调遇到阻力即止，插入过深或用力过猛易损伤大脑中动脉环造成SAH，过短则不能阻断血流。线栓法制作大鼠MCAO模型的插线深度在1.65～2.00 cm是有效安全范围。本实验根据大鼠体重，我们的体会是进线深度至颈总动脉分叉处足1.8～2.0 cm时线栓已进入大脑前动脉并堵住大脑中动脉入口。

3.4 栓线残端的处理目前关于栓线残端的处理，文献报道的很少，在试验中我们体会到这也是影响结果的重要因素之一。孔卫国等[8]认为如栓线残端留在体外过长，大鼠清醒后会自己将栓线拔出，造成提前灌注；如过短，拴线会缩回肌肉内，而大鼠清醒后头部的活动已造成栓线残端在体内弯曲，有一定张力，容易刺破血管。本实验我们采用栓线外留1 cm有颜色标记的残端，在拔栓线时容易寻找，且长短合适，未发生上述报道情况。

3.5 并发症蛛网膜下腔出血(SAH)为该模型最常见的并发症，本研究据估计至少3只大鼠死于SAH；手术过程中插线可以引起血管内皮的损害从而导致血栓形成，为避免血栓形成，本实验使用肝素处理栓线；在插线过程中应尽量保持栓线与血管方向最大一致性，动作轻柔，栓线及头端平整圆滑，也可以预防血栓形成；此外我们在麻醉前使用少量阿托品能有效预防动物呼吸道分泌物增多引起的窒息。

3.6 脑梗死面积本实验脑梗死灶主要位于纹状体和皮质，呈苍白色，未缺血部分呈红色，说明模型制作成功。参考大鼠脑图谱，MCAO大鼠缺血部位位于尾状核、苍白球、内囊后肢、颞及额叶皮层、部分下丘脑和丘脑；根据TTC染色和图像分析处理后，对不同梗死脑片参考大鼠脑图谱进行了组织功能学定位得出了大鼠MCAO手术后在不同片层的梗死面积比值。结果表明，采用不同线栓头制备MACO大鼠模型，计算脑梗死体积密封胶涂覆线栓头组比传统加热球形头线栓组测得相对脑梗死体积稍有增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

综上所述，本实验对采取两种线栓头处理的线栓法制备大鼠MCAO/R模型，术中对大鼠体重及线栓的处理、线栓直径、插入深度等影响建模的因素进行了严格控制，模型制作取得预期效果；模型制作在神经功能评分方面差异无统计学意义(P＞0.05)，两组的模型成功率及稳定性相近；模型制作手术操作时间有差异，第二组模型制作操作时间少于第一组，第二组较第一组易操作，涂敷效果理想，线栓头端大小更易控制；大鼠神经功能缺失评分高低与脑梗死体积比的大小呈相同变化趋势，神经功能缺失评分高的大鼠，其脑梗死体积比也大。用密封胶涂覆过的线栓与传统制作方法相比，造成的缺血再灌注模型也同样可靠。

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Jap stroke, 1989,20(1):84.

[2]罗勇,董为伟.Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究[J].重庆医科大学学报,2002,27(1):l-3.

[3]Zea Longa E,Weinstein PR,CarisonS,et a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,(20):84-91.

[4]Koizuni jL,Yoshida Y,Nakazawa T,et a1.Experimental studies of ischemia brain:A new experimental model of cerebra/embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemia area [J].Jap J stroke,1986,8(1):1.

[5]Bederson JB,pittsL H,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stork,1986,17(3):472-476

[6]吉训明,凌锋,赵喜庆,等.改良可逆性局灶性脑缺血模型建立[J].介入放射学杂志,2005(2):178-181.

[7]马常生,马文领,戴维国,等.插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究[J].解剖学杂志,1999,22(3):209.

[8]孔卫国,吴晓牧,张昆南,等.大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的制作及经验体会[J].实用临床医学,2010,11(3):1-3.

Study on twoMethodsof making suture-embolus for the model of middle cerebral artery occlusion reperfusion in rats.

TIAN Ying1,LIU Yi2,YU Hua-lin2.Department of Nursing1,the Second Department of neurosurgery2,the First Affiliated Hospital of Kunming Medial University,Kunming 650032,Yunnan,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect of twoMethodsof making suture-embolus,and to provide more stable and reliable animal models for experimental study of cerebral ischemia.MethodsThirty male Sprague-Dawley(SD)rats(250～280 g)were randomly divided into two groups,with 15 rats in each group.The rats of group one were subjected to temporary MCAO/R by using the method of Zea Longa(the tip of suture-embolus be heated to round),and those of group two were subjected to Koizumi(the tip of suture-embolus be wrapped by sealant).By recording the time of making MCAO/R model,the grade of neurobehavioral function of rats,calculating the infarct volume ratios and analyzing the relationship between the latter two,the success ratio and stability of twoMethodsof making suture-embolus were evaluated.ResultsThere was no significant difference on the evaluation of neurobehavioral function and on the volume ratios of brain infarction.The stability of the two models was similar.There was the same trend between the neurobehavioral function and the volume of brain infarction.The operate time of group two is shorter than group one.The difference between two groups has statistical significance(P＜0.01).ConclusionThe method for group two(the tip of suture-embolus can be wrapped by sealant,and its size can be controlled more easily)is easier to operate and need shorter time than the method for group one(the tip of suture-embolus be heated to round).

Middle cerebral artery occlusion reperfusion;Model;Suture-embolus method;Rat

R-332

A

1003—6350（2014）03—0320—03

2013-06-07)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0125

云南省高层次卫生技术人才学科带头人项目(编号：D201246)

刘艺。E-mail：chowputty@sohu.com