香榧古树的遗传差异性

何 明，董雷鸣，刘浩凯，张 辉，曾燕如，钱秋凤，喻卫武，戴文圣

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

香榧古树的遗传差异性

何 明，董雷鸣，刘浩凯，张 辉，曾燕如*，钱秋凤，喻卫武，戴文圣

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

对香榧主产地浙江省诸暨、绍兴、嵊州、东阳、磐安的5个香榧古树群体共149个样品进行了SRAP标记分析，共检测到260个位点，其中多态位点170个，多态位点占为65.38%（PPL%）；群体观察到的等位基因数（Na）为1.653 8，有效等位基因数（Ne）为1.2713，基因多样性指数（H）为0.169 6，Shannon信息指数（I）为0.266 4；群体总的基因多样性指数（Ht）平均为0.1694，分化系数（Gst）为0.144 2，群体内基因多样度（Hs）为0.145 0，群体间基因流（Nm）为2.967 5；利用加权平均数法（UPGMA）对香榧古树居群间进行了聚类分析，结果东阳、嵊州两个居群先聚在一起，再与磐安居群聚在一起，而绍兴和诸暨居群聚在一起，最后再与磐安、东阳、嵊州居群聚在一起。研究结果表明，香榧古树接穗来源非唯一，是一个栽培类型，同时群体间有基因交流，既有分离又保持相对较高的相似性。

香榧；SRAP；遗传差异

榧树（Torreya grandis）隶属红豆杉科榧属，为我国特有的古老物种之一，系第三纪孑遗植物[1]。香榧（T.grandis cv.Merrillii）是榧树的优良变异类型经过人工选育后嫁接繁殖栽培的优良栽培类型[2]，也是目前榧树中唯一进行人工规模化栽培的优良栽培类型，起源于浙江省的会稽山区，具有千年的栽培历史，以其特有的形态特征、生物学特性、经济性状和产地分布而区别于其他榧树自然类型，具有食用、药用、材用、绿化等多种用途[3]。近年来香榧的经济效益不断增长，因而在其生态适应区得到了大力推广与发展，在榧树自然分布区安徽、江西等省大量引种栽培。其种仁炒熟后松脆可口，营养丰富，香味独特，有化痰、止咳、润肺、明目等功效。此外，香榧还可以提炼出具有抗癌活性的生理活性物质——紫杉醇[4]。

国外由于没有香榧种植栽培历史，对香榧的研究报道极少。20世纪90年代开始，黎章矩等对香榧栽培类型中的性状分离和再选择进行了较系统的研究，从香榧中选出了70多个高产优质的优株。从其研究结果看，香榧内分离已很明显。韩宁林等也有类似的发现[5]。近年来，香榧栽培类型内退化和分离已普遍显现，有的成年树单株产量从几千克到几百千克不等，各地都有相当比例的成年树产量很低，甚至十多年、几十年不结实。分析其原因，可能：①香榧嫁接起源母株不具备唯一性；②多次嫁接繁殖及其他的人为生产干预引起了分离及退化。因此，有必要开展香榧古树的分子评价，探讨主产区香榧的来源与分离程度，为今后保持香榧优良遗传本质措施的制订提供理论依据。

香榧的主产地在浙江会稽山区的5个县（市），即诸暨、绍兴、嵊州、东阳、磐安，中心产区不乏千年古树。这五个县市现有结实香榧大树约10万株左右，其中诸暨市约4万余株，嵊州市2.83万株，绍兴县1.7万株，东阳市1.0万株，磐安县3 900余株；100年生以上大树占80%以上，其中300 ～ 1 300 a的古树超万株，它们多以单株或小片古树群的形式存在[6]，是浙江省现存的古树名木群体中数量最多的树种。

本研究利用SRAP标记分析技术，以香榧主产地浙江会稽山区的5个县（市）——诸暨、绍兴、嵊州、东阳、磐安的香榧古树（100年以上）样本为实验材料，评价古树群体的遗传差异性。相关的内容尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料采自香榧主产地浙江会稽山区诸暨、绍兴、嵊州、东阳、磐安5个县（市）的香榧古树林。采样时由当地老农做向导，确保采样株的年龄在100 a以上。由于香榧是榧树的优良变异类型经过人工选育后嫁接繁殖栽培的优良栽培类型，因此每个群体单株间至少相距100 m。采摘的叶片存放在带硅胶的塑料袋中，带回实验室后－40℃下保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测 DNA提取与检测采用刘浩凯等优化的改良CTAB法[7]。

1.2.2 SRAP标记分析与产物检测 刘浩凯等参照沈登峰的方法[8]，对包括PCR反应体系、引物筛选及电泳在内的SRAP分析体系进行了优化。本文采用的是优化后的方法体系[7]。

1.2.3 数据分析 电泳图谱每一条带（DNA片段）为一对引物的结合位点。对于多态位点，有扩增产物的记作1，反之记为0，获得二元数据矩阵，并计算多态位点百分率（PPL，%）。用Popgene 1.32分析观察到的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性（H）、香农信息指数（I）、基因多样性指数（Ht）、居群内基因多样性（Hs）、居群间基因分化系数（Gst），并基于Gst计算居群间的基因流Nm =绘制基于亲缘关系的居群聚类图，评价群体内及群体间的遗传差异性。

2 结果与分析

2.1 样品采集

从浙江省磐安（PA）、东阳（DY）、嵊州（SZ）、绍兴（SX）、诸暨（ZJ）分别采集了32、25、30、30、32个单株，共149个样品。

2.2 DNA 的提取

采用改良CTAB法提取的香榧基因组DNA浓度较高，平均大于1 000 ng/μL，有的甚至高达3 000 ng/μL，且纯度较高，OD260/OD280值1.8 ～ 2.0（表1）。电泳检测表明，提取的DNA条带清晰，质量高（图1），可以用于后续的实验。

表1 部分样品的DNA浓度及OD值Table 1 Concentration of gDNAs extracted from some of samples and their OD values

图1 香榧基因组DNA的琼脂糖电泳检测Figure 1 Electrophoresis profile of gDNAs extracted from T.grandis cv.Merrillii

2.3 SRAP 标记分析

用筛选出的10对SRAP引物组合（表2）对149份香榧样品进行DNA扩增，共检测到260个清晰且可重复的有效位点，其中多态性位点170个，多态位点百分率为65.38%（图2，表2）。各对引物扩增的位点数为4～31个，扩增片段大小为100 ～ 1 000 bp，每对引物扩增出的多态位点百分率因引物而异，为22.22% ～ 96.88%。

图2 部分样品的SRAP扩增谱带（引物对F1R1）Figure 2 SRAP amplification band of the DNAs of some samples (primer pair: F1R1)

表2 SRAP引物组合及扩增结果Table 2 SRAP primer pairs and their amplification results

2.4 香榧古树群体的遗传差异性分析

在居群水平上，所有引物扩增产物的多态性在不同居群中的分布数量不同，不同居群的多态位点百分率为43.85% ～ 56.54%，由高到低依次是东阳、嵊州、诸暨、磐安、绍兴居群；基于Shannon信息指数、Nei's基因多样性指数、观测的等位基因数及有效等位基因数的居群排列顺序也相同，结果5个居群中东阳居群的遗传差异性最大，绍兴居群则最小。

5个香榧居群的Ht平均为0.169 4，Hs平均 0.145，Gst平均为 0.144 2，Nm平均为2.967 5，表明香榧居群内遗传差异性高于居群间，不同居群间遗传分化相对较低。

表3 香榧5个居群的遗传参数值Table 3 Genetic parameters in T.grandis cv.Merrillii from 5 counties

2.5 香榧古树居群间的关系

5个古树居群（PA、DY、SZ、SX、ZJ）的遗传相似度在0.954 3 ～ 0.981 2，平均为0.964 5，平均遗传距离为0.036 2，说明相似度较高；DY和SX之间的遗传距离最小，为0.018 9；SZ与SX间的遗传距离最大，为0.046 8（表4）。

表4 香榧古树5个群体的遗传相似性（对角线上）和遗传距离（对角线下）Table 4 Nei’s genetic identity and genetic distance of T.grandis cv.Merrillii among 5 counties

基于 Nei's遗传距离对各居群进行UPGMA聚类可知（图 3），东阳居群和嵊州居群聚在一起，再与磐安居群聚在一起；绍兴居群和诸暨居群聚在一起，最后再与东阳、嵊州、磐安居群聚在一起。

图3 香榧古树5个居群基于Nei’s遗传相似性的UPGMA聚类图Figure 3 UPGMA dendrograme based on Nei’s genetic identity of T.grandis cv.Merrillii From 5 counties

3 讨论

利用SRAP分子标记技术对 5个香榧古树群体的遗传多样性和遗传分化进行了分析，结果表明，香榧物种水平的多态位点百分率PPL达65.38%，群体水平的PPL变幅较大，在22.22% ～ 96.88%，且东阳 ＞ 嵊州 ＞ 诸暨 ＞ 磐安 ＞ 绍兴。与其他裸子植物基于ISSR或RAPD的PPL进行比较，香榧比银杏（PPB = 52.27%）、水杉（PPB = 38.62%）和银杉（PPB = 32%）天然群体[9～11]要高得多。这说明香榧其接穗来源非唯一，是一个栽培类型；同时，经过上千年的无性繁育，加上榧树这个物种本身雌雄异株，香榧的授粉树为榧树的特性，在香榧这个栽培类型内产生了遗传分化。因此，香榧本身具有进行再选择的潜力及必要，同时也具有开展优良雄性种质资源选育的必要。

5个香榧古树群体的Ht为 0.169 4，说明个体间存在基因变异。其中有 14.42%的遗传差异存在于群体间，85.58%的遗传差异存在于群体之内，Gst为0.144 2，低于远交物种和多年生物种的平均值（Gst = 0.22和Gst = 0.19）[12]，表明香榧遗传差异主要集中在群体内。与雌性榧树相比[7]，香榧Gst要高于榧树，其余参数Ne、H、I、Ht、Hs、PPL、Nm等均低于榧树；群体间遗传相似度在0.95以上，说明香榧群体间既有基因交流，又保持相对较高的一致性。相对而言，5个居群中东阳居群的遗传差异性最大，绍兴居群的遗传差异性最小，这一现象是否与香榧的起源有关还有待于进一步探讨。

基因流是影响群体内部和群体间遗传差异程度的重要因素[13]。遗传结构是通过物种群体内和群体间遗传分化来体现的，基因流的大小也可以反映群体遗传结构的大小。一般来说，基因流大的物种，种群间遗传分化小，大的基因流可以阻止群体间的遗传分化[14]。Hamrick等[15]认为，基因流Nm大于1，就足以抵制遗传漂变的作用，也同时防止了群体分化的发生。本研究中香榧古树群体物种水平上的基因流（Nm）为2.967 5，表明群体之间存在着比较频繁的基因交流，有效地阻止了遗传漂变的发生，群体之间的遗传差异不明显。香榧为雌雄异株风媒植物，且栽培较为集中，各群体间的地理位置较近，有利于群体间的基因交流。现实生产中，香榧与榧树间自由杂交，只要是采自香榧的种子多是可食的，而大多数榧树的种子食用质量差，多用于实生繁殖，用作嫁接香榧的砧木。这也说明香榧是一个栽培类型。研究发现，从香榧与榧树种子的品尝评价看，种粒小，种形细长，淀粉质量分数低，油脂质量分数高的榧树种子风味品质好，反之一般不能直接食用[6]。尽管香榧种子自由授粉产生，结果在香榧栽培类型内产生变异，但似乎香榧本身有一种选择雄性花粉的机制，使得香榧种子具有含油率高、可食的特质。

香榧的存在已有千年的历史，其古树群体应该得到保护。但其在长期栽培过程中的退化、分离在所难免。为了保持香榧的品质，有必要对其进行再选择复壮。

[1] 张绍尧，丁炳杨.《浙江植物志》（总论卷）[M].浙江科技出版社，1993.

[2] 黎章矩，程晓建，戴文圣，等.香榧品种起源考证[J].浙江林学院学报，2005，22（4）：443－448.

[3] 陈力耕，王辉，童品璋.香榧的主要品种及其开发价值[J].中国南方果树，2005，34（5）：33－34.

[4] WANG Jianfeng, HUANG Yaojian, FANG Meijuan, et al.Brefeldin A, a cytotoxin produced by Paecilomyces sp.and Aspergillus clavatus isolated from Taxus mairei and Torreya grandis [J].FEMS Immunol Med Microbiol，2002，34（1）：51－57.

[5] 韩宁林，胡文翠，王东辉，等.香榧优良品种细榧内的4个优良类型调查研究[J].林业科学研究，2007，（5）：604－608.

[6] 程晓健，黎章矩，戴文圣，等.榧树种质资源调查与评价[J].果树学报，2009，26（5）：654－658.

[7] 刘浩凯，胡树恒，董雷鸣，等.雌性榧树4个居群遗传多样的SRAP分析[J].经济林研究，2014（3）：30－35.

[8] 沈登锋.榧树种质资源的收集、评价与核心种质的确定[D].临安：浙江农林大学，2011.

[9] 葛永奇，邱英雄，丁炳扬，等.孑遗植物银杏群体遗传多样性的ISSR分析[J].生物多样性，2003，11（4）：276－287.

[10] 李晓东，黄宏文，李建强.孑遗植物水杉的遗传多样性研究[J].生物多样性，2003，11（2）：100－108.

[11] 汪小全，刘正宇.银杉遗传多样性的RAPD分析[J].中国科学（C辑），1996，26（5）：436－441.

[12] Nybom Hilde.Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants [J].Mol Ecol，2004，13（5）：1 143－1 155.

[13] Slatkin M.Gene flow and the geographic structure of natural populations[J].Science，1987，3576198（787）：236.

[14] Ellstrand Norman C，Elam Diane R.Population genetic consequences of small population size：implications for plant conservation [J].Annu Rev Ecol Syst，1993：217－242.

[15] Hamrick JL，Godt MJW，Sherman-Broyles SL.Gene flow among plant populations: evidence from genetic markers.In Experimental and Molecular Approaches to Plant Biosystematics [M].1995：215－232.

Genetic Differences in Ancient Torreya grandis cv.Merrillii Trees

HE Ming，DONG Lei-ming，LIU Hao-kai，ZHANG Hui，ZENG Yan-ru*，QIAN Qiu-feng，YV Wei-wu，DAI Wen-sheng
（Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Leaves from 149 ancient Torreya grandis cv.Merrillii trees were collected in 5 counties (cities) such as Dongyang (DY), Pan’an (PA), Shengzhou (SZ), Zhuji (ZJ) and Shaoxing (SX), Zhejiang province.SRAP (sequence related amplified polymorphism) analysis on 149 samples resulted that a total of 260 loci was detected, among them 170 of polymorphic (Np), accounting for 65.38% of the total one.Number of alleles (Na) was 1.653 8, number of effective alleles (Ne) 1.271 3, Nei’s gene diversity index (H) 0.1696, Shannon Information index (I) 0.266 4, total gene diversity (Ht) 0.1694, genetic differentiation (Gst) 0.144 2, gene diversity within population (Hs) 0.145 0 and gene flow (Nm) 2.967 5.Cluster analysis indicated that the scions of the old trees may not be from the same source and there were gene exchanges among populations, which led to separation but relatively high identity.

Torreya grandis cv.Merrillii; SRAP; genetic difference

S718.46

A

1001-3776（2014）06-0001-05

2014-06-09；

2014-10-10

浙江省教育厅科研项目（Y201121027）；省科技厅浙江省果品农业新品种选育重大科技专项（2012C12904-12）

何明（1979－），女，山东肥城人，助理研究员，硕士，从事森林培育研究；*通讯作者。