固相萃取与毛细管电泳在线联用接口的设计与评价

李金祥，孙 岩，王雅琳

(辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连 116029)

固相萃取与毛细管电泳在线联用接口的设计与评价

李金祥，孙 岩，王雅琳

(辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连 116029)

研究报道一种用于固相萃取与毛细管电泳在线联用的新接口。该接口采用流动阀原理和鞘流式设计，操作条件优化后, 对接口的性能进行了评价。 利用该接口, 进样效率高达98%, 表明该接口内不存在样品稀释效应; 4 h内100次连续进样的峰高、峰面积及迁移时间的RSD平均值分别为2.4 %、5.4 %、3.1 %, 表明该接口具有很好的稳定性和重现性。

固相萃取；毛细管电泳；接口

毛细管电泳分析法(capillary electrophoresis, CE)因具有柱效高、速度快、样品和试剂消耗少和分离模式多等诸多优点而获得广泛关注。 该方法通常利用光学原理进行柱上检测。 然而, 由于进样体积和毛细管内径的制约, 毛细管电泳光检测分析法的浓度灵敏度较低, 致使该方法的应用范围受到了严重限制[1]。解决该问题最有效的方法之一是, 在进行电泳分离之前, 利用固相萃取(solid-phase extraction, SPE)技术对样品进行预浓缩[2-5]。 为了实现SPE与CE的高效在线联用, 需要一个特殊设计的接口。 迄今为止, 已经报道了多种联用接口[6-12], 这些接口可以实现SPE和CE的联用, 并在不同程度上获得了成功, 但仍存在许多问题。最主要的问题是接口的死体积过大, 导致了严重的样品扩散和稀释效应, 致使萃取效率降低。

本研究设计了一种新的鞘流式流动阀接口, 使死体积被减小至纳升级, 降低了样品的稀释效应, 从而提高了进样效率。同时接口具有制作简单、容易实现自动控制等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外-可见光检测器(Model 500, Lab Alliance, 美国); 恒流注射器泵(LSP01-1 A, 保定兰格); 高压直流电源(±30 kV, 北京英达科技); 显微镜(XSP-02-640x, 江西凤凰); 数码摄像头(深圳奥尼); 继电器开关板(深圳龙岗); 双通道色谱工作站(N-3000, 浙江大学); 微型精密酸度计(B-212, 日本); 超声波清洗仪(SK2200H, 上海科导); 石英毛细管(河北永年)。

1-氨基-8-萘酚-3,6-二磺酸钠盐(H酸, C10H9NO7S2); 8-羟基喹啉-5-磺酸(C9H7NO4S); Na3PO4、NaOH (天津市天河化学试剂厂); 实验用水均为二次蒸馏水; 所有无机试剂均为分析纯。

1.2 SPE-CE系统装置

联用系统装置如图1所示。SPE柱被一段内径为25 μm, 长度为10 cm的毛细管空柱所取代, 用一个恒流泵(上) 以一定速度驱动样品流经该毛细管到达接口内, 模仿SPE洗脱过程, 进而简化了 SPE系统。显微镜与数码摄像头相连, 聚焦于接口的中心部位直接观察和录像。两个直流高压电源分别预设在一个较低和一个较高的电压下, 用来电动进样和电泳分离。电泳毛细管内径50 μm, 外径375μm, 总长30 cm, 有效长度13 cm。用 UV 检测器进行柱上检测，恒流泵(下)驱动缓冲电解质溶液流过接口控制CE进样，两个电源和缓冲液泵由继电器开关板自动控制。石英毛细管在使用前, 依次用0.1 mol·L-1NaOH 溶液、水和Na3PO4缓冲溶液各冲洗5 min。

图1 SPE-CE系统装置示意图

1.3 接口装置

鞘流式流动阀接口装置如图2所示。样品毛细管出口与电泳毛细管入口之间存有一定缝隙, 二者同轴放置在同一水平通道中。缓冲液从毛细管外壁与连接管内壁之间所形成的环形通道流过, 一部分流入 CE 系统中, 使样品在高压电场下分离, 其余部分则携带 SPE 柱流出物成废液流出。CE 分离结束后, 分离电压回零。此时, 缓冲液停止流动, 样品流出液则直接收集在两个毛细管缝隙之间, 在进样电压下实现进样。

图2 鞘流式流动阀接口结构示意图

2 结果与讨论

2.1 接口操作条件的优化

对于接口的操作来说, 影响其性能的因素主要包括 SPE 与 CE 毛细管之间的间距、缓冲液的流速、积累与进样时间、冲洗时间等。本实验选择5 mmol·L-1H酸为待测液, 其流速设定为3 μL·min-1; 10 mmol·L-1Na3PO4溶液为缓冲液, 对接口的操作条件进行了优化。

经过优化, SPE 与 CE 毛细管间的距离70～120 μm 为宜。若间距过大, 会造成进样量重现性的降低, 而且所需的样品积累时间也要相应的加长; 而间距过小, CE 毛细管入口端的残余组分不易被及时地冲洗干净。缓冲液的流速范围为16～80μL·min-1, 若流速低于16μL·min-1, 缓冲液的冲洗力度不够, 不能保证样品溶液全部远离 CE 毛细管入口端, 会造成连续进样现象; 而流速大于80μL·min-1时, 易产生残压和层流现象, 谱图上峰高降低且出峰时间缩短。此外, 适宜的时间程序: 积累与进样时间为3 s, 冲洗时间为1s。

2.2 接口性能的评价

本研究在上述优化的操作条件下, 主要从进样效率、重现性、柱效与对称性三方面对接口的性能进行了评价。

2.2.1 接口的进样效率

接口的进样效率, 即样品在接口的浓度利用率, 直接影响到系统对样品的检测浓度。以5 mmol·L-1的H酸为研究对象, 在相同的操作条件下, 分别采用直接电泳进样、经接口进样两种方式进行CE分离比较, 选取所得谱图的一部分进行排列, 结果如图3所示。从峰高即浓度的比值中可推知样品经接口切换后浓度为初始浓度的98 %, 这表明在积累与进样的过程中, 样品几乎没被稀释。经计算比较得知, 两个毛细管间距离为100 μm时的死体积为20 nL, 而积累与进样时间为3 s时样品的流出体积为150 nL, 是死体积的7.5倍。也就是说, 此时两个毛细管间全部充满着样品, 因而进样的浓度几乎就是样品的原始浓度。这进一步说明了该鞘流接口的死体积小, 稀释效应小, 从而不会对萃取效率带来影响。

图3 直接电泳进样与经接口进样的比较

2.2.2 接口的重现性

为了评价接口的长期稳定性和重现性, 以5 mmol·L-1H酸为样品, 在约 4 小时内进行了100次电泳连续进样实验, 峰高、峰面积、迁移时间的散点图如图4所示。经计算, 峰高、峰面积及迁移时间的相对标准偏差(RSD)平均值分别为2.4 %、5.4 %、3.1 %, 均在误差允许范围内。从图中可以看出, 峰高、峰面积并没有明显的漂移, 但迁移时间却从1.52 min漂移到了1.65 min, 造成这一现象的原因可能是由于在长时间内缓冲溶液 pH 和室温发生了变化。研究发现, 在这一时间段内, 由于缓冲溶液吸收了空气中的二氧化碳使得其 pH 从 11.5 降至 11.2, 室温从29 ℃降至25 ℃, 温度的下降会导致缓冲液粘度的增加。pH 的降低和粘度的增加均会使电渗流有所下降, 迁移时间漂移。即便这样, 所得的结果也表明该套系统足以实现SPE 与 CE 的高效在线联用。

图4 100次连续CE分离的峰高、峰面积及迁移时间

2.2.3 柱效与对称性

在检测波长 250 nm 的情况下, 通过分离 H 酸和 8-羟基喹啉-5-磺酸的混合溶液考察了接口对CE分离的影响。表1对比了直接电泳进样和经接口进样时两种组分的柱效和峰的对称性。因UV检测的浓度灵敏度较低, 增大样品浓度, 增加进样体积或增加检测窗口长度都会导致严重的峰展宽。此外, 与压力进样相比, 电动进样中存在电荷歧视效应, 更容易造成峰展宽现象, 使得柱效损失。从峰的顶点向半峰宽所在线段作垂线, 相交后的形成的两条线段分别为 a 和 b, b 与 a 的比值即为峰的对称性。实验发现峰形拖尾, 造成这一现象的原因一方面是由于在分离过程中样品栓在电泳毛细管中轴向扩散, 另一方面是由于电荷歧视效应的存在使得分析物的自身泳动方向与电渗流方向相反。但在适当的操作条件下, 经接口进样与直接电泳进样相比, 柱效和对称性变化不大, 说明接口并没有对CE的分离带来影响。

3 结论

本实验选取性能良好且成本低廉的材料，设计并制作了一种新型鞘流式流动阀接口装置，通过对电泳进样重现性和稀释效应的考察证实，本接口在吸纳现有几种接口装置的优点的同时，有效克服了缺陷，具有制作方法简单、制作成本低廉、柱外扩散和稀释效应极小等显著优点。可以很好地实现固相萃取与毛细管电泳的在线联接。

[1] Baker, D. R. Capillary Electrophoresis[M]. New York: Wiley, 1995: 244.

[2]Ramautar, R.，de Jong, G. J.， Somsen, G. W. Developments in coupled solid-phase extraction-capillary electrophoresis 2009-2011[J]. Electrophoresis, 2012, 33: 243-250.

[3]Puig, P.， Borrull, F.， Calull, M.，et al. Recent advances in coupling solid-phase extraction and capillary electrophoresis (SPE - CE)[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26(7): 664-678.

[4]Simpson Jr, S. L. Quirino, J. P. Terabe, S. On-line sample preconcentration in capillary electrophoresis fundamentals and applications[J]. J Chromatogr A, 2008, 1184: 504-541.

[5]Tempels, F. W. A.， Underberg, W. J. M.， Somsen, G. W.，et al. Design and application of coupled SPE - CE[J]. Electrophoresis, 2008, 29: 108-128.

[6]Tempels, F. W. A.， Underberg, W. J. M.， Somsen, G. W.，et al. On-line coupling of SPE and CE-MS for peptide analysis[J]. Electrophoresis, 2007, 28: 1319-1326.

[7]Tempels, F. W. A.， Underberg, W. J. M.， Somsen, G. W.，et al. Chromatographic preconcentration coupled to capillary electrophoresis via an in-line injection valve[J]. Anal Chem, 2004, 76: 4432-4436.

[8]Tempels, F. W. A.， Teeuwsen, J.; Kyriakou, I. K.，et al. Chromatographic preconcentration coupled on-line to capillary electrophoresis via a Tee-split interface[J]. J Chromatogr A, 2004, 1053: 263-268.

[9]Priego-Capote, F.， Luque de Castro, M. D. On-line preparation of microsamples prior to CE[J]. Electrophoresis, 2007, 28: 1214-1220.

[10]Lee, W. H.， Wang, C. W.， Her, G. R. Staggered multistep elution solid-phase extraction capillary electrophoresis/tandem mass spectrometry: a high-throughput approach in protein analysis[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25: 2124-2130.

[11]Hooker, T. F.， Jorgenson, J. W. A transparent flow gating interface for the coupling of microcolumn LC with CZE in a comprehensive two-dimensional system[J]. Anal Chem, 1997, 69: 4134-4142.

[12]Guzman, N. A. Immunoaffinity capillary electrophoresis applications of clinical and pharmaceutical relevance[J]. Anal Bioanal Chem, 2004, 378: 37-39.

Design and Evaluation of a New Interface for the On-line Coupling of Solid-phase Extraction with Capillary Electrophoresis

LI Jin-xiang, SUN Yan, WANG Ya-lin

(School of Chemistry and Chemical Engineering, Liaoning Normal University, Dalian Liaoning 116029, China)

A new interface was presented for the on-line coupling of solid-phase extraction (SPE) with capillary electrophoresis (CE). The interface adopted a sheath flow design based on the flow gating principle. After optimizing the operation conditions, the performance of the interface was evaluated. By this interface, injection efficiency of concentration of effluent form SPE capillary into the CE system was up to 98%, indicating that almost no dilution effect occurred during injections in the interface. The relative standard deviations (RSD%) obtained through 100 consecutive runs over a 4.0 h period were 2.4%, 5.4% and 3.1%, respectively. These RSD values shown that the interface has a good stability and reproducibility.

solid-phase extraction; capillary electrophoresis; interface

2013-10-16

李金祥(1964- )，男，黑龙江绥化人，辽宁师范大学化学化工学院教授，博士，从事高效分离与灵敏检测技术研究。

O657.7

A

1008-178X(2014)01-0069-04