大豆油中DNA提取方法及PCR检测技术研究

王德莲 刘冬虹 黄宇锋 聂炎炎 陈立坚

（广州市质量监督检测研究院 广东广州 510110）

大豆油中DNA提取方法及PCR检测技术研究

王德莲 刘冬虹 黄宇锋 聂炎炎 陈立坚

（广州市质量监督检测研究院 广东广州 510110）

通过比较CTAB法、SDS法、《SN/T1203-2010》标准方法以及试剂盒法等4种方法，发现试剂盒方法能够快速提取到大豆油中的DNA，并用实时荧光PCR方法成功检测到了大豆油中的大豆内源基因和外源基因。

大豆油；DNA提取；PCR扩增

1 前言

自从转基因大豆被批准种植以后，世界上每年的种植面积都在增加，至今已增加到5000多万公顷，并且还有增加的趋势。中国是转基因大豆的主要进口国家之一。进口转基因大豆多用于提取大豆油。2002年我国农业部发布的《农业转基因生物标识管理办法》及卫生部出台的《转基因食品卫生管理办法》规定，包括大豆、玉米、油菜、棉花、番茄5类17种产品以及以转基因动植物、微生物或者其直接加工品为原料生产的食品和食品添加剂必须进行标识[1,2]。除此之外，食用植物油的核酸检测技术在植物油原料成分鉴定、掺假食用油及潲水油的鉴定领域的需求也日显突出[3]。人们日常食用的大豆油多为精炼大豆油，DNA提取非常困难，导致后续的转基因检测很难实现。因此，研究精炼大豆油中DNA的的提取方法，不仅对实施食品标签和标识，保护消费者的知情权和选择权具有重要意义，同时对食用油脂的掺假检测也具有重要的参考意义。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 原料

本研究所用的大豆原油采自粮油加工厂，共5个样品，散装，均是以转基因大豆为原料加工而成。大豆精炼油共52个样品，其中40个购自大型和小型超市，标识显示为转基因大豆加工而成。12个购自于粮油市场，散装，不确定是否为转基因大豆加工而成。表1是部分样品的信息。

表1 大豆原油和大豆精炼油的样品信息

（续表）

2.1.2 主要试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、氯仿，异戊醇（24：1）、TE缓冲液、异丙醇、购自Promage公司。DNA提取试剂盒：Wizard Magnetic DNA Purification System for Food 、DNA Purification Kit。PCR反应体系中的10×Exbuffer，dNTP，TaqDNA聚合酶购自TAKARA，所用引物由Invitrogen公司合成。

2.1.3 主要仪器

3-30K离心机：SIGMA公司；DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；HS501D往复式振荡机：IKA公司；Sartorius电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；A10超纯水仪：MILLIPORE公司；Smartspecplus 核酸蛋白分析仪：BIO-RAD公司；eppendorf移液器：德国爱本德公司；ABI7300实时荧光PCR仪：美国AB公司

2.2 方法

2.2.1 大豆油DNA的提取与纯化

2.2.1.1 CTAB法 见文献[4]

所有样品均经过前处理后再采用参考文献的方法进行DNA提取，前处理方法参照标准方法。样品量分别为大豆原油500mL，精炼大豆油3L。

2.2.1.2 SDS法 见文献[5]

所有样品均经过前处理后再采用参考文献的方法进行DNA提取，前处理方法参照标准方法。样品量分别为大豆原油500mL，精炼大豆油3L。

2.2.1.3 标准SN/T1203-2010《食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法》

以下简称标准方法。DNA前处理方法与标准一致，标准中提到的试剂盒由于已经停产无法得到，而标准中提到可以用与之等效的DNA提取试剂盒，笔者采用了Promega的DNA Purification Kit进行后续的DNA提取。样品量分别为大豆原油500mL，精炼大豆油3L。

2.2.1.4 试剂盒法

采用Promage公司的Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒，在操作上稍作修改，具体过程如下：取40 mL待检大豆油于50 mL离心管中，取4管，共160 mL油样。在每个离心管中加入试剂盒中提供的Buffer A 2 mL，在振荡器上充分震荡混匀5min，再加入1 mL Buffer B，在振荡器上充分震荡混匀5 min。室温放置10min。加入3 mL precipitation solution，振荡混匀10min。4000r/min离心30min，弃上层油样。如需提取更多的DNA，可在该步骤继续加入油样，混匀，离心后弃上层油样，之后用移液器小心吸取水相到另外一支50 mL离心管中，加入100 μL Magnesil PMPS，混匀。再加入0.9体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置1h，期间颠倒5次。DNA吸附于磁珠上，上磁力架除去液相，1min后倒掉液体，加入1 mL70％乙醇洗涤磁珠，为避免管壁上剩余油脂的干扰，将乙醇和磁珠的混合物转移到新的1.5 mL的离心管中，之后上磁力架，1min后吸掉液体，重复此步骤两次。65℃干燥磁珠，之后加入100 μL TE缓冲液,旋涡混匀，65℃温浴10min，上磁力架，1min后转移液体到另一支1.5 mL离心管中，为进一步去除影响PCR扩增的物质，需再加入50 μL Magnesil PMPS，重复异丙醇沉淀、乙醇洗涤和磁珠吸附步骤，最后加入50 μL TE洗脱磁珠，将洗脱液转移至0.6mL的离心管中，该管中的液体即为已经提取好的DNA。-20℃保存该管，留待下一步PCR分析用。所有DNA提取过程均设置阳性对照、空白对照和阴性对照作为质量控制。

2.2.2 实时荧光PCR检测

用引物和探针包括大豆内源基因（Lectin），外源基因（35S，NOS,EPSPS）来自文献[6]。经多次PCR扩增最终确定最佳反应体系（见表1）和最佳反应条件为50℃ 2min，95℃ 10min，95℃15s，58℃ 1min，40-45个循环。

表2 实时荧光PCR反应体系

3 结果与分析

3.1 DNA提取

表3 4种大豆油DNA提取方法的结果比较

本实验室采用CTAB法、SDS法、标准方法、试剂盒法对5个大豆原油、52个大豆精炼油DNA进行提取发现，上述四种提取方法均能从大豆原油中提取到DNA，提取成功率为100％。其DNA提取浓度约18.2-32.6 ng/μL，DNA提取OD260/280值约为1.32-1.78,其中标准方法和试剂盒法的提取浓度高于CTAB法、SDS法, OD260/280值也高于前两种方法。但是对于精炼大豆油DNA的提取，四种方法所提取的DNA用核酸蛋白分析仪进行测量时发现同一样品的平行试验数值差异很大，无法测得有效的DNA浓度与OD260/280值。分析认为是因为精炼大豆油是大豆原油经过滤、脱胶、脱酸、脱色、脱臭等加工工艺的深加工产品，其中的核酸被严重降解，含量非常低[3]，且在核酸的提取过程中也会导致核酸的部分损失。导致所提取的DNA含量达不到仪器的检测底限，无法得到稳定的数据。但DNA的提取质量可以在实时荧光PCR检测时得到反映。此外CTAB法、SDS法和标准方法所用样品量都较大(3L），且样品在提取之前都需要进行大量的前处理工作，耗时长。试剂盒法所用样品量少（160mL），且不需要进行大量的前处理，耗时短。

3.2 实时荧光PCR扩增

3.2.1 大豆原油实时荧光PCR扩增

图1 大豆原油中大豆内源基因（lectin）实时荧光PCR结果

图2 大豆原油中大豆外源基因CP4-EPSPS的实时荧光PCR结果

针对大豆原油中的大豆内源基因（lectin）和外源基因CP4-EPSPS的实时荧光PCR检测结果分别见图1与图2。从结果中可看到4种方法从大豆原油中提出的DNA的实时荧光PCR能产生明显的扩增曲线，且四种方法针对大豆原油所提取的DNA的实时荧光PCR时Tm值差异不大，其中Tm值最低的为试剂盒法所提取的DNA。

3.2.2 大豆精炼油实时荧光PCR扩增

图3 精炼大豆油中大豆内源基因（lectin）实时荧光PCR结果

图4 精炼大豆油中大豆外源基因CP4-EPSPS实时荧光PCR结果

针对大豆精炼油中的大豆内源基因（lectin）和外源基因CP4-EPSPS的实时荧光PCR检测结果分别见图3与图4。可以看到，CTAB法和SDS法从精炼大豆油中提取的DNA经实时荧光PCR均不能产生明显的扩增曲线。标准方法和试剂盒法提取的DNA经实时荧光PCR能产生明显的扩增曲线。相比较，试剂盒法所提取的DNA的Tm值明显小于标准方法所提取的DNA的Tm值，而这种差异在大豆原油的扩增结果中不明显。

本研究采用4种核酸提取方法对52个大豆精炼油进行了DNA提取，通过实时荧光PCR检测发现，CTAB法和SDS法均未能从52个样品中提取到能用于实时荧光检测的DNA。标准方法和试剂盒法都从部分样品中提取到了目标DNA。其中采用标准方法从52个样品中成功提取到了16个样品的DNA.提取成功率为30.8％。试剂盒法从52个样品中成功提取到了35个样品的DNA，提取成功率为67.3％。值得注意的是35个样品中全部检测到了外源基因，说明这些样品所用原料皆为转基因大豆。其次，用试剂盒法未能提取到用于实时荧光PCR检测的DNA的17个样品，采用标准方法同样也未能提取到足够用于PCR检测的DNA。具体信息见表4。

表4 对52个大豆精炼油采用四种DNA提取方法的实时荧光PCR结果比较

4 结论

（1）CTAB法和SDS法均能够从大豆原油中提取到目标DNA，但是前处理复杂、费时。而且对于精炼大豆油DNA的提取上述两种方法均不适用。

（2）标准方法和试剂盒法均能从大豆原油和大豆精炼油中提取到目标DNA，且两种方法在大豆原油的提取中差异不明显。在针对精炼大豆油的DNA提取中，从实时荧光PCR结果可以明显的看到标准方法和试剂盒法所提取的DNA结果差异较大。首先，从DNA提取的成功率来看，标准方法从52个样本中成功的提取到了16个样本的目标DNA，提取成功率为30.8％。试剂盒法从52个样本中成功提取到了35个样本的目标DNA，提取成功率为67.3％，其提取成功率约为标准方法的2倍。其次，标准方法对样品量的需求大（至少3L），前处理耗时长。试剂盒法所需样品量小(160mL)，约为标准方法的1/20。且不需要对样品进行前处理，提取周期短，更具有时效性。因此，笔者认为试剂盒法提取精炼大豆油的DNA明显优于标准方法。

（3）虽然试剂盒法在样品检出率方面有所提高。但该方法的提取率也未能达到100％，说明在精炼大豆油DNA提取方法上还有待进一步的研究。

（4）本研究所采用的DNA提取试剂盒法，不仅适用于精炼大豆油的DNA提取，而且适用于实时荧光PCR检测。对食用油脂的品种鉴定和掺假检测都具有一定的参考意义。

［1］ 农业部. 农业转基因生物标识管理办法. 2002.

［2］ 农业部. 转基因食品卫生管理办法. 2002.

［3］ 杨冬燕，邓汉超，杨永存, 等，精炼食用植物油PCR检测技术研究[J]. 中国卫生检验杂志，2010,20（4）：700-702.

［4］Innocenzo Muzzalupo, Massimiliano Pellegrino, Enzo Perri. Detection of DNA in virgin olive oils[J]. Res Technol, 2007, 224：469-475.

［5］ 许冬倩，郝义波. 一种有效地油脂DNA的提取方法[J]. 食品研究与开发，2008,29（10）：42-45.

［6］SN/T 1203-2010 食用油脂中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法[S].

DNA Extraction and PCR Amplifi cation for Soybean Oil

Wang Delian, Liu Donghong, Huang Yufeng, Nie Yanyan, Chen Lijian
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou, Guangdong, 510110)

Facing to the diffi culty in DNA refi ning from soybean oils, we compared 4 methods of DNA Extraction, including CTAB, SDS, SN/T1203-2010 and reagent to determine an optimized method. It was found that the reagent method was a rapid and suffi cient method for DNA extraction from soybean oil. We also detected the DNA of both endogenous and exogenous genes using real-time fl uorescent quantitative PCR.

Soybean Oil; DNA Extraction; PCR Amplifi cation

S565.1

广州市质量技术监督局科技项目（2013kj33）