结核分枝杆菌抗原特异反应性白细胞介素—22在结核性胸膜炎鉴别诊断中的应用

原艳明等

[摘 要] 目的：研究胸液单个核细胞经结核分枝杆菌特异性抗原肽刺激后表达的白细胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）浓度测定在结核性与恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值。方法：将确诊的52例结核性胸膜炎和35例恶性胸腔积液患者胸液单个核细胞分离后，使用结核分枝杆菌特异抗原肽（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）刺激培养，测定细胞培养液上清中IL-22和干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）浓度，对结果进行统计学分析。结果：结核性胸膜炎组IL-22浓度明显高于恶性胸液组（P<0.01）。ROC曲线显示IL-22用于结核性胸膜炎的诊断敏感性、特异性和准确性分别为90.38%、80.56%和85.23%，其诊断效能与IFN-γ相当（P>0.05）。结论：结核分枝杆菌抗原特异反应性IL-22测定可作为对结核性胸膜炎诊断的重要参考指标。

[关键词] 白细胞介素-22；结核性胸膜炎；恶性胸水；鉴别诊断

中图分类号：R521.7 R446.62 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2014）03-001-03

[Abstract] Objective：To research the diagnosis value of the measurement of the concentration of Interleukin-22（IL-22）generated by the pleural fluid mononuclear cells（PFMCs）stimulated by specific MTB antigen peptides in tuberculous Pleurisy effusions（TPE）and malignant pleural effusions（MPE）. Methods： The pleural fluid mononuclear cells（PFMCs）of 52 cases of TPE and 35 cases of MPE were separated and cultivated with the stimulation of specific MTB antigen peptides（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）， the concentration of IL-22 and Interferon-γ（IFN-γ）of the PFMCs culture fluid supernatant were measured and the results were statistically analyzed. Results：The concentration of IL-22 in TPE group was significantly higher than MPE group（P<0.01）.ROC curve showed the sensibility 、specificity and the accuracy of IL-22 were 90.38%、80.56% and 85.23% when used in the diagnosis of TPE， the diagnose efficiency was equal to IFN-γ（P>0.05）. Conclusion： The measurement of the Mtb-antigen-specific IL-22 can be regarded as an important reference index in the diagnosis of TPE.

[Key words] Interleukin-22；Tuberculous pleurisy；Malignant pleural effusions；differential diagnosis

胸腔积液是临床常见病症，早期确诊难度较大，目前仍依赖于特异性病原体的检出或胸膜活检发现典型病理改变。但由于检出阳性率低，影响了患者获得及时有效的诊断和治疗。因此探寻灵敏度、特异度均好的检测指标，对临床意义重大。本文通过测定87例确诊的胸腔积液患者胸液单个核细胞（pleural fluid mononuclear cells，PFMCs）表达结核分枝杆菌抗原特异反应性白细胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）的浓度，与已广泛应用于临床的干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）作比较，探索其在结核性胸膜炎与恶性胸水鉴别诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择解放军309医院2012年4月至2013年9月期间住院确诊的胸腔积液患者。结核性胸膜炎组（结核组）患者52例，男34例，女18例，年龄17～76岁，平均（36±17）岁。诊断依据：1）胸液或胸膜活组织中抗酸杆菌阳性（涂片、培养或TB-DNA检测）；2）胸膜活检发现典型结核病变如结核性肉芽肿或干酪样坏死物改变；3）典型临床表现、PPD皮试阳性、渗出性胸腔积液改变、外周血淋巴细胞干扰素释放检测及抗结核治疗有效。恶性胸腔积液组（恶性组）35例，男15例，女20例，年龄36～82岁，平均（59.9±13.7）岁。诊断依据：胸膜活检发现恶性病变和/或胸液脱落细胞中发现恶性细胞。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 所有入组患者均在治疗前，无菌操作下常规胸穿留取胸液50 mL，1800 rpm/min离心5 min，将沉淀细胞用Ficoll进行密度梯度离心，获取PFMCs，充分洗涤后，用RPM1640完全培养液调整细胞数为1×106/mL，部分200 ?L体系细胞悬液内加入结核分枝杆菌（early secreted antigenic target-6，ESAT-6）、（culture filtrate protein-10，CFP-10）抗原肽库（终浓度为40 ?g/mL），于5% CO2、37 ℃培养18 h后取细胞培养液上清，- 80℃保存待测。1周内完成样品检测。

结核分枝杆菌特异性抗原肽库（ESAT-6，CFP-10）由北京赛百盛公司合成，纯度大于95%。Ficoll密度梯度淋巴细胞分离液购自GE biosciences（USA），RPMI 1640培养液购自GIBCO（USA），细胞因子检测试剂盒购自eBioscience；流式细胞仪为Beckman coulter PC500型。

1.2.2 IL-22和IFN-γ浓度测定 使用Flowcytomix 流式细胞仪检测样品。根据eBioscience细胞因子检测试剂盒说明书操作，设阴性对照孔，主要步骤如下：将标准品、微球、生物素偶联的检测抗体按比例配置顺次加入，避光室温孵育2 h；清洗后按照FlowCytomix Pro 2.1分析软件（eBioscience公司提供）计算比例加入链亲和素-PE，避光室温孵育1 h，再次清洗后进行流式检测。用标准品控制组间变异，组间变异小于15%。使用FlowCytomix Pro 2.1 分析软件读取所得流式检测原始LMD文件，建立各检测因子的标准曲线后，软件自动计算出样品浓度，结果以pg/mL表示。

1.2.3 统计学分析 数据以中位数（四分位间距）表示。组间比较用非参数Mann-Whitney检验，应用受试者工作特征曲线（ receiver operating2 characteristic curve，ROC），以Youdens指数最大的截断点为诊断结核性胸膜炎的标准，计算IL-22的诊断效能，率的比较用x2检验。此次试验采用GraphPad Prism 5统计软件处理，以P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 两组细胞培养上清液中IL-22和IFN-γ测定结果

结核组PFMCs经结核分枝杆菌特异性抗原肽库刺激后产生的IL-22浓度[1161（3279.8）] pg/mL与培养液上清液比浓度显著升高（P<0.01），与恶性组比较，差异存在统计学意义（P<0.01），与IFN-γ检测结果一致。见表1。

2.2 结核分枝杆菌抗原特异反应性IL-22和IFN-γ对胸腔积液的鉴别诊断价值

以Youdens指数最大的截断点为诊断结核性胸膜炎的标准，计算IL-22和IFN-γ对结核性和恶性胸腔积液的鉴别诊断价值，表2可见两组间差异（P>0.05）无统计学意义。

3 讨论

胸腔积液是临床常见病症，结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病是主要病因[1]。由于涂片检测抗酸杆菌阳性率不足5%，结核菌培养的诊断敏感性也只有58%[2，3]，确诊并非易事。寻找敏感性和特异性较高的检测指标以辅助胸腔积液的病因诊断一直是国内外学者的研究热点。

IL-22是Th22细胞（helper T cell 22，Th22）的主要产物[4]，也可由Th1（helper T cell 1，Th1）、Th17（helper T cell 17，Th17）、NK细胞（natural killer cell，NK cell）等多种免疫细胞表达[5]。当机体感染病毒或细菌等病原体后，IL-22能够激活其它免疫细胞，帮助机体控制炎症对抗感染[6]，并通过介导组织表达急性炎症蛋白、粘蛋白或抗微生物肽等物质，使慢性炎症中的组织保持完整[7]。在结核免疫中，IL-22可通过促进向自然杀伤细胞溶酶体传送结核分枝杆菌，加强吞噬溶酶体的溶解作用[8]，并可能通过增加基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMPs）的表达，参与结核性胸膜炎的免疫病理[9]。Qiao D等[10]证实在结核性胸腔积液中存在结核分枝杆菌特异的Th22细胞，使用（ESAT-6、CFP-10）抗原肽刺激后，IL-22 mRNA显著上调，表达产物增加。

结核分枝杆菌抗原特异IFN-γ检测目前已成为一种重要的诊断结核的生物标记物。受到结核分枝杆菌抗原刺激而致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生特异性IFN-γ，特异性升高的IFN-γ量可以反映体内结核特异性T细胞应答的强弱，依此可间接判断结核分枝杆菌的感染情况[11]。抗原ESAT6、CFP10是重要的T细胞抗原，能诱导机体产生记忆性免疫应答，是致病性MTB特有而BCG缺失的片段[12]，能够区分真性结核感染，排除BCG接种产生的干扰。

本研究以IL-22为观察指标，使用结核分枝杆菌特异抗原肽（ESAT-6、CFP-10）刺激培养87例胸腔积液患者PFMCs，通过检测培养液上清中IL-22的浓度，并作统计学分析，发现结核组IL-22在刺激后上清中表达水平显著升高（P<0.05），与Qiao D研究结果一致，且结果明显高于恶性组（P<0.05）。用于诊断结核性胸膜炎时，敏感性和特异性分别达到90.38%和80.56%，与IFN-γ诊断效能相当。因此认为，IL-22与IFN-γ类似，可作为结核病诊断金标准之外的一个非常有效的辅助诊断方法。

参 考 文 献

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