黄芪甲苷对大鼠心肌局部缺血再灌注损伤的改善作用及其对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

张 静,马翠丽,王志国

(1.吉林大学第二医院药品管理部,吉林长春 130041;2.吉林大学中日联谊医院风湿免疫科,吉林长春 130033; 3.吉林大学南岭校区医院药剂科,吉林长春 130022)

黄芪甲苷对大鼠心肌局部缺血再灌注损伤的改善作用及其对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

张 静1,马翠丽2,王志国3

(1.吉林大学第二医院药品管理部,吉林长春 130041;2.吉林大学中日联谊医院风湿免疫科,吉林长春 130033; 3.吉林大学南岭校区医院药剂科,吉林长春 130022)

目的:观察黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对大鼠心肌局部缺血再灌注(I/R)损伤的改善作用及其对PI3K/Akt/ m TOR信号通路的影响,阐明AS-Ⅳ对心肌I/R损伤的保护作用及可能机制。方法:选择60只雄性Sprague-Dawley大鼠,采用阻断左冠状动脉前降支血流30 min再灌注120 min的方法制备局部I/R模型,随机分为模型组(等体积生理盐水)、AS-Ⅳ组(于再灌注前5 min静脉注射10 mg·kg－1AS-Ⅳ)、PI3K抑制剂Wortmannin (WOR)组(于再灌注前10 min静脉注射0.6 mg·kg－1WOR)和AS-Ⅳ＋WOR组(于再灌注前5、10min依次静脉注射10 mg·kg－1AS-Ⅳ和0.6 mg·kg－1WOR)。同时选取15只同周龄大鼠作为正常对照(对照组)。分析各组大鼠I/R后的心脏质量、心肌缺血程度和梗死程度及心功能情况[左室收缩期平均压(LVSP)、舒张末期压力(LVEDP)、短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)];采用Western blotting法检测心肌梗死区Akt及m TOR磷酸化(p-Akt和p-m TOR)水平,特异性荧光探针DHE染色分析心肌活性氧自由基水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠心肌缺血程度、梗死程度、LVEDP、心肌p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR及活性氧自由基水平均升高(P＜0.05),LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05)。与模型组比较,AS-Ⅳ组大鼠心肌缺血程度、梗死程度、LVEDP及活性氧自由基水平均降低(P＜0.05),心肌p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR及LVSP、FS和EF均升高(P＜0.05);与AS-Ⅳ组比较,WOR组和AS-Ⅳ＋WOR组大鼠心肌缺血程度、梗死程度、LVEDP及活性氧自由基水平均升高(P＜0.05),心肌p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR及LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05)。结论:AS-Ⅳ对心肌I/R损伤有改善作用,可降低心肌梗死及氧化应激程度并提高心功能,其机制可能通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路发挥作用。

黄芪甲苷;心肌缺血再灌注;PI3K/Akt/m TOR信号通路

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤为心肌血供中断一定时间内恢复血液灌注,而原缺血区发生较再灌注前更为严重的损伤或功能障碍[1-2]。I/R后心肌功能不仅未得到恢复,反而损伤加重,可增加心血管事件风险,如梗死面积扩大及心律失常等[3]。心肌I/R损伤可导致心脏功能受损和心肌细胞损伤等,严重影响了基础疾病的预后,同时也限制了冠状动脉溶栓术、介入术及搭桥术的应用[4-5],所以降低心肌I/R损伤对提高心血管疾病的疗效有重要意义。黄芪是一种豆科植物,其提取物具有多种作用,如抗氧化、扩血管和抗炎等[6],黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)是黄芪提取物的有效成分,具有正性肌力作用,可用于心脏保护[7]。AS-Ⅳ可双向调节心肌细胞内钙稳态[8],对异丙肾上腺素诱导的心肌梗死有保护作用并可改善心肌肥厚症状[9-10]。目前对AS-Ⅳ改善心肌I/R损伤作用的研究少有报道。本研究通过探讨AS-Ⅳ对心肌I/R损伤的改善作用及其对PI3K/ Akt/m TOR信号通路的影响,阐明AS-Ⅳ对心肌I/R损伤的保护作用及可能机制,为心肌I/R损伤的保护提供有效可行的措施。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器75只雄性Sprague-Dawley大鼠购自北京维通利华公司,合格证号:SCXK(京)2002-2003,体质量250～300 g。AS-Ⅳ购自成都曼斯特生物科技有限公司,伊文斯蓝和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自美国Amresco公司,PI3K特异性抑制剂Wortmannin(WOR)和Triton X-100购自美国Sigma公司,胰蛋白酶购自美国Gibco公司,BCA蛋白分析试剂盒购自碧云天生物科技公司,一抗羊抗鼠p-Akt、Akt单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,兔抗鼠p-m TOR、m TOR单克隆抗体和内参GAPDH购自美国Cell Sigaling Technology公司,二抗HRP标记的IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯。5417R型高速低温离心机购自德国Eppendorf公司,ELX800型酶标仪购自美国Bio-Tek公司,YJ-875型净化工作台购自苏州净化仪器厂,TS100型倒置相差显微镜购自日本Nikon公司,Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳电泳槽购自美国Bio-Rad公司。

1.2 动物分组选取60只大鼠制备I/R模型(阻断冠状动脉左前降支血流30 min再灌注120 min),并随机分为4组(n＝15):模型组、AS-Ⅳ组、WOR组和AS-Ⅳ＋WOR组。同时选取同周龄15只大鼠作为对照组。AS-Ⅳ组大鼠于再灌注前5 min静脉注射10 mg·kg－1AS-Ⅳ,WOR组大鼠于再灌注前10 min静脉注射0.6 mg·kg－1WOR,AS-Ⅳ＋WOR组大鼠分别于再灌注前10 和5 min依次静脉注射0.6 mg·kg－1WOR和10 mg·kg－1AS-Ⅳ,而模型组和对照组大鼠仅给予等体积生理盐水,各组大鼠的注药体积均为1 m L。所有大鼠术前均在相同环境下(12 h/12 h明暗周期、60%～70%湿度及饮水饮食可自由获取)饲养1周,状态稳定后进行实验。每组有8只大鼠先后用于心功能检测、心脏解剖学指标和梗死面积评估,剩余7只中取4只用于心肌蛋白提取及Western blotting检测,3只用于心肌活性氧自由基检测。

1.3 心肌局部I/R模型的制备采用腹腔注射戊巴比妥钠(100 mg·kg－1)麻醉大鼠并给予机械通气。将充满生理盐水的PE-50聚乙烯管插入颈动脉和颈外静脉分别进行血流动力学检测和静脉给药及补液,术后稳定20 min后于胸部左侧第4肋间打开胸腔,将心包膜剪开,采用6-0丝线结扎冠状动脉左前降支血流30 min再灌注120 min。对照组大鼠仅穿线但不结扎,其余步骤相同。

1.4 心功能检测于再灌注结束后检测各组大鼠心功能。预先插入颈动脉的PE-50聚乙烯管末端与Power Lab数据采集和处理系统相连,于I/R后检测各组大鼠心功能指标:左室收缩期平均压(left ventricle systolic pressure,LVSP)、左室舒张末期压力(left ventricle end-diastolic pressure, LVEDP)、短轴缩短率(fractional shortening,FS)和射血分数(ejection fraction,EF)。

1.5 心脏解剖学指标及梗死面积评估在完成心功能检测后采用过量麻醉法处死大鼠,快速取出心脏,冲洗干净后称质量并记录,生理盐水经冠状动脉冲洗,再次结扎冠状动脉左前降支并用1%伊文斯蓝灌流,完成后将心脏切成4～5片,用TTC复染15 min,采用中性甲醛固定,拍照,采用Optimax图像处理软件分析缺血面积(红色)、梗死面积(白色)及正常面积(蓝色),根据公式计算各组大鼠心肌缺血程度和梗死程度。缺血程度＝缺血面积/正常面积×100%,梗死程度＝梗死面积/缺血面积×100%。

1.6 心肌蛋白提取及Western blotting检测p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR于再灌注结束后快速取出心脏左室前壁心肌,剪碎并充分匀浆,加入细胞裂解液,高速离心保留上清,采用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。从每组中取50μg蛋白与等体积上样缓冲液混匀,采用10%SDS-PAGE电泳法分离,半干转法转移至NC膜,分别加入p-Akt(1∶200)和p-m TOR(1∶300)一抗4℃孵育过夜,加入二抗(1∶3 000)室温孵育2 h,采用ECL法进行显色处理,胶片曝光后观察条带光密度;然后采用洗脱液洗NC膜,加入Akt(1∶300) 和m TOR(1∶200)一抗4℃孵育过夜,二抗(1∶3 000)孵育2 h后,显色处理,计算条带光密度,分别计算p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR的比值。

1.7 荧光探针DHE染色法检测心肌活性氧自由基水平于再灌注结束后取心脏左室心肌,均分成2份:一份取中部冠状切面进行石蜡包埋,切成5μm厚,加入2μmol·L－1特异性荧光探针DHE染色,避光反应15 min,采用荧光显微镜观察荧光强度;另一份剪碎后加入胰蛋白酶将心室肌细胞消化成单细胞悬液,加入5μmol·L－1DHE,避光反应30 min,在488 nm激发波长下,采用酶标仪检测每组细胞的荧光强度,以荧光强度表示活性自由基水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。各组大鼠LVSP、LVEDP、FS、EF、心脏质量、缺血程度、梗死程度、p-Akt/ Akt、p-m TOR/m TOR和荧光强度均以±s表示,多组样本均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q法。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌I/R后的心脏解剖学及梗死指标各组大鼠心脏质量比较差异均无统计学意义(P＞0.05);与对照组比较,模型组大鼠心肌缺血程度、梗死程度均升高(P＜0.05);AS-Ⅳ组大鼠心肌缺血程度和梗死程度均低于模型组,但仍高于对照组(P＜0.05);与AS-Ⅳ组比较,WOR组和AS-Ⅳ＋WOR组大鼠心肌缺血程度和梗死程度均升高(P＜0.05),但与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠心肌I/R后的心功能与对照组比较,模型组大鼠LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05),LVEDP升高(P＜0.05);与模型组比较,AS-Ⅳ组大鼠LVSP、FS和EF均升高(P＜0.05), LVEDP降低(P＜0.05),且与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);与AS-Ⅳ组比较,WOR组和AS-Ⅳ＋WOR组大鼠LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05),LVEDP均升高(P＜0.05),但与模型组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠心肌I/R后心脏解剖学及梗死指标Tab.1 Heart anatomy and infarction indicators of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

表1 各组大鼠心肌I/R后心脏解剖学及梗死指标Tab.1 Heart anatomy and infarction indicators of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

∗P＜0.05 compared with control group;△P＜0.05 compared with model group;＃P＜0.05 compared with AS-Ⅳgroup.

Group Heart mass(m/g)Degree of ischemia(η/%)Degree of infarction(η/%) Control 1.21±0.15 0 0 Model 1.10±0.27 47.5±7.6∗43.2±5.1∗AS-Ⅳ1.24±0.14 39.2±5.4∗△35.6±4.3∗△WOR 1.16±0.16 46.8±6.2∗＃44.0±5.7∗＃AS-Ⅳ＋WOR 1.18±0.22 48.4±7.1∗＃42.3±6.8∗＃

表2 各组大鼠心肌I/R后的心功能Tab.2 Heart function of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

表2 各组大鼠心肌I/R后的心功能Tab.2 Heart function of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

∗P＜0.05 compared with control group;△P＜0.05 compared with model group;＃P＜0.05 compared with AS-Ⅳgroup.

Group LVSP(P/mm Hg)LVEDP(P/mm Hg)FS(η/%)EF(η/%) Control 122.5±6.9 7.4±1.3 44.5±4.2 81.0±2.9 Model 106.4±5.8∗12.6±2.5∗20.2±1.4∗46.3±2.7∗AS-Ⅳ114.8±4.5∗△9.2±1.7∗△31.6±3.1∗△57.6±1.2∗△WOR 108.7±5.2∗＃12.7±2.8∗＃21.4±2.3∗＃44.3±2.3∗＃AS-Ⅳ＋WOR 102.2±6.3∗＃11.5±3.1∗＃23.0±1.8∗＃42.8±3.6∗＃

2.3 各组大鼠心肌I/R后心肌PI3K/Akt/m TOR信号通路的蛋白磷酸化水平与对照组比较,模型组大鼠p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值均升高(P＜0.05);AS-Ⅳ组大鼠p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值均高于模型组(P＜0.05); 与AS-Ⅳ组比较,WOR组和AS-Ⅳ＋WOR组大鼠p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值均降低(P＜0.05),但与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1和表3。

2.4 各组大鼠心肌I/R后心肌活性氧自由基水平

与对照组比较,模型组荧光强度升高(P＜0.05);AS-Ⅳ组荧光强度低于模型组(P＜0.05),但仍高于对照组(P＜0.05);与AS-Ⅳ组比较, WOR组和AS-Ⅳ＋WOR组的荧光强度均升高(P＜0.05),与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3和图2(插页四)。

3 讨论

黄芪是一种应用较为广泛的中药材,用于多种心脏疾病的治疗,其提取物皂苷可改善心功能并降低心肌细胞凋亡[6]。AS-Ⅳ具有多种生物活性,如缓解脑出血灶周围神经元凋亡[11],对异丙肾上腺素诱导心肌梗死具有保护作用[9],提示其具有较好的心血管保护效应。心肌缺血后在一定时间内恢复再灌可伴发心肌I/R损伤,病因尚不清楚,但可降低心功能并增加心肌细胞损伤[12],I/R损伤是目前阻碍缺血心肌从恢复再灌注治疗中受益的主要难题。本研究采用AS-Ⅳ干预大鼠心肌I/R损伤具有一定的可行性。

图1 各组大鼠心肌I/R后心肌p-Akt/Akt和p-m TOR/ m TOR表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of p-Akt/Akt and p-m TOR/m TOR in myocardium of rats after myocardial I/R in various groupsLane 1:Control group;Lane 2:Model group;Lane 3:AS-Ⅳgroup; Lane 4:WOR group;Lane 5:AS-Ⅳ＋WOR group.

表3 各组大鼠心肌Akt和m TOR磷酸化水平及荧光强度Tab.3 Phosphorylation levels and fluorescence intensities of Akt and m TOR in myocardium of rats after I/R in various groups(n＝4,±s)

表3 各组大鼠心肌Akt和m TOR磷酸化水平及荧光强度Tab.3 Phosphorylation levels and fluorescence intensities of Akt and m TOR in myocardium of rats after I/R in various groups(n＝4,±s)

∗P＜0.05 compared with control group;△P＜0.05 compared with model group;＃P＜0.05 compared with AS-Ⅳgroup.

Group p-Akt/Akt p-m TOR/m TOR Fluorescence intensity Control 0.22±0.03 0.18±0.04 65.3±7.1 Model 0.43±0.05∗0.34±0.06∗147.6±11.5∗AS-Ⅳ0.67±0.09∗△0.64±0.05∗△113.8±8.6∗△WOR 0.37±0.08∗＃0.35±0.05∗＃142.0±9.4∗＃AS-Ⅳ＋WOR 0.45±0.06∗＃0.37±0.03∗＃138.2±10.2∗＃

本研究证实了AS-Ⅳ对大鼠心肌I/R损伤有保护作用,主要表现在:①降低梗死程度和缺血程度;②改善心功能;③降低心肌氧化应激水平。心肌I/R可引起左心室功能紊乱,进一步发展可导致心力衰竭[13-14]。本研究中TTC/Evans blue染色法显示:AS-Ⅳ可显著降低梗死程度。同时为进一步分析AS-Ⅳ对心肌I/R大鼠心功能的影响,本研究分析I/R后的心功能指标(如LVSP、LVEDP、FS和EF),结果显示:与模型组比较,AS-Ⅳ组的LVEDP降低,FS和EF升高,表明AS-Ⅳ可改善心肌I/R大鼠心功能。

PI3K/Akt/m TOR信号通路在心肌I/R损伤中起关键作用[15],心肌I/R可导致该信号通路激活[16-17]。PI3K是Akt和m TOR的上游激酶,2种蛋白的磷酸化形式可用于反映该信号通路的活性[18]。本研究结果显示:模型组p-Akt和p-m TOR水平均较高,提示I/R时该通路处于激活状态。而当给予AS-Ⅳ后,2种蛋白的磷酸化形式进一步升高,提示AS-Ⅳ可通过激活PI3K/Akt/ m TOR信号通路发挥心肌保护效果,而I/R时该通路本身处于激活状态,可能与反馈机制有关。为进一步探讨AS-Ⅳ是否通过PI3K/Akt/m TOR通路发挥心肌保护作用,本研究应用PI3K抑制剂WOR后发现:AS-Ⅳ的效应可被消除,表明PI3K/Akt/m TOR信号通路介导了AS-Ⅳ的保护效应。

研究[19]表明:氧化应激是I/R损伤的诱因,其中活性氧自由基是公认的引起I/R损伤的主要介质。活性氧自由基是外源性氧化剂或细胞内有氧代谢过程中产生的具有很高生物活性的含氧化合物的总称,在胞内信号级联反应中主要充当信号分子,在调控细胞生物学行为中起到重要作用。I/R期间生成的活性氧自由基加重了心肌I/R损伤。PI3K/Akt/m TOR信号通路可调控ROS水平[20],本文作者推测:AS-Ⅳ可通过激活PI3K/Akt/ m TOR信号通路来降低活性氧自由基水平,因此进一步分析AS-Ⅳ对I/R大鼠心肌氧化应激水平的影响。本研究中DHE染色发现:模型组大鼠心肌细胞的荧光强度高于对照组,提示I/R时伴有氧化应激,而AS-Ⅳ组大鼠心肌细胞荧光强度降低,同时PI3K抑制剂可消除AS-Ⅳ对活性氧自由基的降低效果,表明AS-Ⅳ可通过PI3K/Akt/m TOR信号通路来改善氧化应激水平,也进一步表明以降低氧化应激为切入点以发挥AS-Ⅳ保护心脏功能具有一定的可行性。

综上所述,AS-Ⅳ对心肌I/R损伤有改善作用,可降低心肌梗死及氧化应激程度并提高心功能,其机制可能通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路发挥作用。

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Improvement effects of astragalosideⅣon myocardial focal ischemia-reperfusion injury and its influence in PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

ZHANG Jing1,MA Cui-li2,WANG Zhi-guo3
(1.Department of Drug Administration,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 2.Department of Rheumatology,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China; 3.Department of Pharmacy,Nanling Campus Hospital,Jilin University,Changchun 130024,China)

ObjectiveTo observe the improvement effects of astragalosideⅣ(AS-Ⅳ)on the myocardial focal ischemia-reperfusion(I/R)injury and its influence in PI3K/Akt/m TOR pathway,and to clarify the protectiveeffect of AS-Ⅳon myocardial I/R injury and the possible mechanisms.MethodsThe left main coronary arteries of 60 Sprague-Dawley rats were occluded for 30 min followed by a 120-min reperfusion to induce I/R model.The rats with I/R injury were randomly divided into model group(normal saline),AS-Ⅳgroup(intravenous injection of 10 mg·kg－1AS-Ⅳ5 min before reperfusion),PI3K inhibitor Wortmannin(WOR)group(intravenous injection of 0.6 mg·kg－1WOR 10 min before reperfusion)and AS-Ⅳ＋WOR group(intravenous injection of 10 mg·kg－1AS-Ⅳand 0.6 mg·kg－1WOR 5 and 10 min before reperfusion,respectively).15 age-matched SD rats were chosen as control group.The heart mass,degrees of infarction and ischemia and cardiac function,including left ventricular systolic mean pressure(LVSP),end-diastolic pressure(LVEDP),fractional shortening(FS)and ejection fraction(EF),of the rats in all groups were analyzed.Western blotting method was used to measure the phosphorylation levels of Akt and m TOR(p-Akt and p-m TOR).The specific fluorescent probe DHE staining was employed to detect the myocardial reactive oxygen species levels.ResultsCompared with control group,the degrees of infarction and ischemia,LVEDP,myocardial levels of p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR and reactive oxygen species levels of the rats were increased(P＜0.05).and the levels of LVSP,FS and EF were decreased in model group(P＜0.05).Compared with the model group,the degrees of infarction and ischemia,LVEDP and reactive oxygen species level were decreased(P＜0.05),while the levels of p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR LVSP, FS and EF of all rats in AS-Ⅳgroup were increased(P＜0.05).Compared with AS-Ⅳgroup,the degrees of infarction and ischemia,LVEDP and reactive oxygen species levels of the rats in WOR group and AS-Ⅳ＋WOR group were increased(P＜0.05),and the myocardial p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR and LVSP,FS,EF were decreased(P＜0.05).ConclusionAS-Ⅳhas improvement effect on myocardial I/R injury.AS-Ⅳcan reduce the extent of myocardial infarction and oxidative stress and improve the heart function,and its possible mechanism may be related to activating PI3K/Akt/m TOR signaling pathway.

astragalosideⅣ;myocardial ischemia-reperfusion injury;PI3K/Akt/m TOR pathway

R363

A

2014-02-19

吉林省发改委专项基金资助课题(2012747)

张 静(1975－),女,吉林省长春市人,主管药师,医学硕士,主要从事药物开发、剂型及临床应用的研究。

王志国(Tel:0431-85095519-810,E-mail:1893913119＠qq.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0991-06

10.13481/j.1671-587x.20140517