Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良

李 新,张舒岩,杨立彬,李 冉,蒋然然,陈治光,李树蕾,李树红

(1.四川农业大学食品学院农产品加工及贮藏工程学系,四川雅安 625000;2.吉林大学第一医院神经外科,吉林长春 130021;3.吉林大学第一医院儿科,吉林长春 130021;4.吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系,吉林长春 130021)

Raw264.7细胞向破骨细胞分化诱导培养体系的改良

李 新1,张舒岩2,杨立彬3,李 冉1,蒋然然1,陈治光1,李树蕾4,李树红1

(1.四川农业大学食品学院农产品加工及贮藏工程学系,四川雅安 625000;2.吉林大学第一医院神经外科,吉林长春 130021;3.吉林大学第一医院儿科,吉林长春 130021;4.吉林大学基础医学院组织学与胚胎学系,吉林长春 130021)

目的:通过改良细胞培养方案建立体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟破骨细胞(OC)的高效培养体系。方法:向Raw264.7细胞培养液α-MEM中添加50μg·L－1M-CSF、100μg·L－1RANKL和1×10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3,于5%CO2、37℃孵箱中培养12 d,每3 d换液1次,每次换液前对细胞进行短暂消化。倒置显微镜下观察细胞形态变化,并利用HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、FITC-phalloidin染色和免疫荧光染色鉴定OC是否成熟并具有吞噬功能。结果:通过改良培养方法,在诱导过程中培养孔内的大部分区域始终保持单层细胞的生长状态。镜下观察和HE染色,诱导第12天时OC胞体覆盖培养面积的70%;FITC-phalloidin染色,伴随着OC成熟,伪足内出现的束状伪足小体逐渐变为环形,最终融合带状肌动蛋白环环绕在胞质周围;免疫荧光染色,诱导12 d后OC表达的降钙素受体(CTR)较前体细胞显著增加, TRAP染色显示OC胞浆内呈现大量红色颗粒。提示获得的OC成熟并具有吞噬功能。结论:本实验通过改良培养方法,联合应用细胞因子50μg·L－1M-CSF、100μg·L－1RANKL和1×10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3建立了体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。

Raw 264.7细胞;破骨细胞;巨噬细胞集落刺激因子;核因子κB受体活化因子配体;1.25二羟基维生素D3

健康成人的骨组织处于一种不断更新和重建的状态。骨重建是一个动态过程,包括骨吸收和骨形成[1]。其中行使骨吸收功能的细胞主要是破骨细胞(osteoclast,OC)[2],行使骨形成功能的细胞是成骨细胞(osteoblast,OB)。正常生理条件下两者处于一种动态平衡,如果这种平衡被打破就会发生一系列疾病[3]。Raw264.7细胞是目前公认的唯一成系的OC前体细胞[4],可表达OC表型的标志基因,能形成骨吸收陷窝[5]。由于巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)在OC形成和分化过程中起关键作用,目前国内外多采用M-CSF和RANKL联合诱导Raw264.7细胞分化为OC,但是诱导效率不高;并且随着培养时间延长Raw264.7细胞将层叠生长,不利于OC分化生成以及观察,这些均是OC诱导亟待解决的问题。为了解决以上两个问题,本实验对Raw264.7细胞培养体系进行了改良优化。由于1α,25-(OH)2D3可直接作用于OC前体细胞,促进OC生成并发挥骨吸收作用,也是OC形成和激活必需的因子[6],本文作者利用M-CSF、RANKL 和1α,25-(OH)2D33种细胞因子的联合作用诱导Raw 264.7细胞分化为OC,同时利用低浓度胰酶短暂消化保证前体细胞始终保持单层细胞的生长状态,旨在建立体外诱导Raw264.7细胞分化为成熟OC的高效培养体系。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

Raw264.7小鼠单核巨噬细胞系购自中科院上海生命科学研究院细胞库。RANKL和M-CSF(美国R&D公司),Hochest33342、FITC-phalloidin 和1α,25-(OH)2D3(美国Sigma公司),α-MEM培养基(美国Gibco公司),抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色试剂盒(上海哈灵生物有限公司),兔抗小鼠降钙素受体(calcitonin receptor,CTR)抗体(北京博奥森公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(以色列Biological Industries公司),Alexa-488标记的山羊抗兔(江苏碧云天公司),其他相关试剂均为国产分析纯。MC0175 CO2培养箱(日本Sanyo公司),IX71电脑型荧光显微镜和Ck40-F200倒置相差显微镜(日本Olympus公司),BCM-1000超净工作台(苏州净化有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 体外诱导Raw264.7细胞分化为OC 将1.6×104m L－1的Raw264.7细胞悬液以0.5 m L/孔接种于24孔培养板培养1 h,去除未贴壁细胞,更换新鲜α-MEM培养液(10%FBS、100 U·m L－1青霉素和100 mg·L－1链霉素),加入M-CSF(50μg·L－1)、RANKL(100μg·L－1) 和1α,25-(OH)2D3(1×10－8mol·L－1),于5% CO2、37℃培养12 d,每3 d换液1次,每次换液时,利用0.125%胰酶消化30 s,使培养孔内的大部分区域仍保持单层细胞的生长状态。

1.2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态 分别在诱导第2、3、6、9和12天,于倒置相差显微镜下观察细胞形态、贴壁情况及单个核细胞融合情况。利用IPP6.0软件计算10个相同单位面积下单核细胞与多核细胞的面积比。

1.2.3 HE染色 分别在诱导第2、3、6、9和12天去除培养液,PBS冲洗3次后用4%多聚甲醛固定细胞,PBS冲洗3次,苏木精染色液染色10 s,自来水返蓝10～20 s,伊红染色3 min,无水乙醇脱水。倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。

1.2.4 FITC-phalloidin染色 取培养6、9和12 d后的OC培养板经PBS冲洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,PBS冲洗3次,加入FITC-phalloidin (1∶100),37℃避光孵育30 min,PBS冲洗3次, Hochest33342复染细胞核10 min,PBS冲洗3次,荧光显微镜下观察OC肌动蛋白分布。

1.2.5 免疫荧光检测CTR表达 培养12 d后将OC培养板用PBS反复冲洗3次,4%多聚甲醛固定10 min,PBS冲洗3次,加入0.3%Triton-X100处理20 min,5%FBS封闭30 min,加入兔抗小鼠CTR抗体(1∶100)4℃过夜;次日以PBS冲洗5次,加入Alexa-488标记的山羊抗兔37℃孵育1 h,PBS冲洗3次,Hochest33342复染细胞核,PBS冲洗3次。荧光显微镜下观察绿色荧光分布范围和荧光强度。

1.2.6 TRAP染色 分别在细胞培养的第2和12天去除培养液,PBS冲洗3次,2.5%戊二醛固定液固定10 min,加入预热的孵育液后于37℃孵育50 min,PBS冲洗3次,于倒置相差显微镜下观察阳性颗粒的分布(TRAP染色阳性颗粒为酒红色)。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜下培养细胞的形态学

在诱导培养的前2 d(图1A),Raw264.7细胞形态未发生显著改变,从第3天开始可见少量较小的OC,细胞核数量2～3个(图1B);第6～9天开始OC数量增多且体积逐渐增大,可见片状伪足和丝状突起,细胞内可见几个到几十个核不等,胞浆内可见大小不等的空泡,此外还可见大量正处于融合中的细胞(图1C和D);至第12天利用IPP6.0软件计算10个相同单位面积下单核细胞与多核细胞的面积比,OC胞体覆盖面积达到培养面积的70%(图1E)。

图1 倒置显微镜观察M-CSF、RANKL和1α,25-(OH)2D3联合诱导Raw 264.7细胞分化为OC的形态学变化Fig.1 Morphologic changes of OC differentiated from Raw264.7 cells induced by M-CSF,RANKL,and 1α,25-(OH)2D3observed under inverted microscopeA:2 d;B:3 d;C:6 d;D:9 d;E:12 d;Bar＝50μm.A:2 d;B:3 d;C:6 d;D:9 d;E:12 d;Bar＝50μm.

2.2 HE染色观察诱导的OC的形态学

培养2、3和6 d后随着诱导培养时间延长, Raw 264.7细胞逐渐聚集融合形成多核OC,细胞核数量逐渐增多(图2A～C,见插页六),培养9 和12 d后,Raw264.7细胞呈圆形或椭圆形,染色质颗粒细小,分布均匀,每个核含2个核仁,胞浆内含有空泡,可见片状伪足,丝状突起不清晰(图2D和E,见插页六)。

2.3 FITC-phalloidin染色观察Raw264.7细胞伪足小体变化

phalloidin能特异性结合细胞内丝状肌动蛋白(F-actin),故FITC-phalloidin染色后,细胞内F-actin呈绿色荧光。伴随着OC的分化,培养6 d 的OC胞质内可见较多F-actin束状聚集形成伪足小体(图3A,见插页六),培养9～12 d的OC胞质中束状的F-actin转变成较多小的环状伪足小体(图3B和C,见插页六)。环状伪足小体存在时间较短,很快在OC周围融合形成相对稳定的带状结构,即肌动蛋白环(图3B和C,见插页六)。

2.4 免疫荧光组织化学染色观察CTR表达

培养12 d的OC中CTR表达量逐渐升高,并从胞质转位到细胞膜,因此细胞膜和核周细胞质中均呈现较强的绿色荧光。而未成熟的OC前体细胞因CTR表达量很少,故核周少量胞质中仅呈现微弱的绿色荧光。见图4(插页六)。

2.5 TRAP染色鉴定OC

倒置相差显微镜下观察,培养12 d后的OC胞质中染色酶活性部位呈红色TRAP阳性颗粒,核周红色颗粒较周边胞质多,往往掩盖细胞核;而培养2 d的未成熟的OC胞质被染成黄色,无红色阳性颗粒。见图5(插页六)。

3 讨论

OC属于一种终末细胞,体外培养只能生存2周,且无法传代,因此体外培养OC比较困难。虽然19世纪80年代Martin等从兔四肢骨中分离出OC[7],但是对OC的研究进展仍较为缓慢。1982年Arai等[8]建立了OC体外培养体系,此后对OC的研究越来越广泛。但目前OC体外培养方法中仍有不足,例如诱导效率不高、Raw264.7细胞层叠生长不利于OC分化和观察等。因此,本实验针对以上问题改良了OC样细胞的体外诱导培养体系,对研究OC的形成、分化、活性及功能具有重要意义。

RANKL是目前已知的唯一能够通过受体直接作用于OC前体细胞、促进其分化为成熟OC的细胞因子,是OC生成的最终决定因子[9]。M-CSF 与OC前体细胞上的受体c-fms结合,促进OC前体细胞的增殖和融合[10],RANKL和M-CSF联合应用可不依赖于其他因子而促进OC的形成和分化[11]。在预实验过程中本文作者对M-CSF和RANKL进行浓度筛选,发现50μg·L－1M-CSF 和100μg·L－1RANKL联合应用时形成的OC数目最多(数据未显示),所以本实验把M-CSF浓度设定为50μg·L－1,RANKL的浓度设定为100μg·L－1。为了进一步提高OC的获得效率,本文作者在M-CSF和RANKL联合应用基础上增加了1α,25-(OH)2D3。1α,25-(OH)2D3能够刺激OC形成和分化[12],在RANKL等的存在下可直接作用于OC前体细胞,通过加强RANKL的作用,促进其生成OC并发挥骨吸收作用[13]。1α,25-(OH)2D3促进OC的形成和分化的能力与培养体系中的浓度有关。1α,25-(OH)2D3的浓度为1×10－6～1×10－9mol·L－1时,OC形成活跃;当浓度为1×10－8mol·L－1时,OC增殖较快,骨吸收最活跃[14]。所以本研究采用1α,25-(OH)2D3的浓度为1×10－8mol·L－1。

此外,如何有效控制细胞保持单层细胞的生长状态一直是困扰OC诱导的难题。本研究利用OC贴壁能力强、不能被消化的特点,在每次换液前用0.125%胰酶消化30 s,在OC仍贴壁的前提下,保留一定数量和密度的前体细胞,使得OC分化形成过程得以继续,并始终保持单层生长状态;由于消化后上清中的细胞已经过细胞因子诱导启动分化过程,所以将其重新接种到新的培养孔中,加入含细胞因子的培养液继续诱导。通过改良培养过程,诱导12 d后,培养孔内的大部分区域仍保持单层细胞的生长状态,并且OC生长面积高达培养面积的70%。

为了验证改良后的方法是否能成功诱导出具有功能的成熟OC,本研究从形态、标志物和功能三方面鉴定了获得的OC。活细胞观察和HE染色显示:培养至第6天,聚集成团的单核细胞逐渐融合形成多核细胞;培养至第9～12天时,圆形或不规则形的多核细胞数量显著增多,胞体较大,细胞核平均3～8个,并且胞质中出现较多空泡,提示OC已经具有吞噬功能。形成伪足是OC成熟和执行吞噬能力的重要结构,所以本文作者检测了伪足小体的形成。F-actin是伪足小体和细胞骨架的主要成分之一,phalloidin能特异性结合F-actin,故本研究采用FITC-phalloidin荧光染色显示OC的细胞轮廓以及伪足小体和肌动蛋白环。随着诱导培养时间延长,OC中伪足小体逐渐由束状演变成环状,最终形成带状的肌动蛋白环。伪足小体的形态学变化标志着OC的成熟[15]。OC成熟后表达特异性的标志物CTR和具有活性的TRAP。CTR在OC前体细胞表达很弱,在成熟OC表达则显著增加[16]。这与本研究的免疫荧光结果一致。本文作者还利用组织化学染色法检测了OC中TRAP的活性,结果显示:培养12 d的OC核周和外围的胞质中均有大量具有活性的TRAP。以上结果证明联合应用M-CSF、RANKL和1α,25-(OH)2D3成功诱导Raw264.7细胞分化为成熟的OC。

综上所述,本研究通过改良培养方法,建立联合应用M-CSF(50μg·L－1)、RANKL (100μg·L－1)和1α,25-(OH)2D3(1× 10－8mol·L－1)体外诱导Raw264.7细胞分化形成成熟OC的高效培养体系。

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Improved induction culture system for Raw264.7 cells to differentiate into osteoclasts

LI Xin1,ZHANG Shu-yan2,YANG Li-bin3,JIANG Ran-ran1,CHEN Zhi-guang1, LI Ran1,LI Shu-lei4,LI Shu-hong1
(1.Department of Agricultural Product Processing and Storage,Food Institute,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625000,China;2.Department of Neurosurgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China;3.Department of Pediatrics,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China; 4.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences, Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo establish a high-performance induction culture system for Raw264.7 cells to differentiate into osteoclasts(OC)in vitro by improving the cell culture program.MethodsThe Raw264.7 cells were cultured withα-MEM medium containing 50μg·L－1M-CSF,100μg·L－1RANKL,and 1×10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3in 5%CO2for 12 d at 37℃.The cells were digested transiently every time before the medium was changed after every three days.The morphologic changes of the Raw264.7 cells were observed by inverted microscope.The maturation and phagotrophic function of OC were identified by HE,TRAP,FITC-phalloidin staining and immunofluorescence.ResultsThe cells remained to grow in single layers all the time in most areas of the well during the whole induction by the improved culture program.The observation results of inverted microscope and HE staining showed that the growth area of the polykaryotic OC reached to 70%of the well on day 12.FITC-phalloidin staining showed that in the maturation of the OC,the cluster-shaped podosomes in the pseudopodia gradually transformed into rings,which finally fused to form a large belt surrounding the periphery of the cytoplasm.The calcitionin receptor(CTR)expressed by OC was markedly enhanced compared with the precursor cells by immunofluroescence staining,and a large number of red granules appeared in the cytoplasm of OC with TRAP staining on day 12.These results comfirmed that the obtained OC were maturated and owned phagotrophic function.ConclusionA high-performance induction culture system for Raw264.7 cells to differentiate into OC in vitro induced by combination of 50μg·L－1M-CSF,100μg·L－1RANKL,and 1× 10－8mol·L－11α,25-(OH)2D3is established by improving the cell culture program.

Raw264.7 cell;osteoclast;macrophage colony-stimulating factor;receptor activator for nuclear factor-κB ligand;1α,25-dihydroxyvitamin D3

R494.26;Q813.1

A

2014-01-07

国家自然科学基金资助课题(31101249)

李 新(1988－),女,吉林省松原市人,在读医学硕士,主要从事胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化鉴定及生理作用研究。

李树红(Tel:0835-2882311,E-mail:xiaoshu.928＠126.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1114-05

10.13481/j.1671-587x.20140540