RP－HPLC 和麝香草酚法检测硝酸盐氮的比较

纪晓娜，刘 晶，左 妍，艾胜书，任志敏，边德军，＊

（1.长春工程学院理学院；2.长春工程学院水利与环境工程学院；3.吉林省城市污水处理重点实验室，长春 130012）

RP－HPLC 和麝香草酚法检测硝酸盐氮的比较

纪晓娜1，3，刘 晶1，3，左 妍1，3，艾胜书2，3，任志敏2，3，边德军2，3，＊

（1.长春工程学院理学院；2.长春工程学院水利与环境工程学院；3.吉林省城市污水处理重点实验室，长春 130012）

针对处理后的城市污水，分别进行了反相高效液相色谱法（RP－HPLC）和麝香草酚法的硝酸盐氮检测试验，并结合检测原理对比研究了2种方法的线性范围、检出限、平行偏差、方法偏差、检测时间和试剂消耗等。结果表明：RP－HPLC的线性范围在2.00～25.00mg·L－1之间，线性相关系数（R2）为0.999 93，检出限为0.001mg·L－1，样品的平行偏差在0.01%～0.33%之间，检测时间为4min，使用了3种药品；麝香草酚法样品的平行偏差在0.83%～12%之间，检测时间为6min，使用7种药品；RP－HPLC相对于麝香草酚分光光度法的方法偏差在－6.3%～8.3%之间。

硝酸盐氮；反相高效液相色谱法；麝香草酚分光光度法；城市污水

0 引言

城市污水包括生活污水、工业废水和降水，城市污水具有总氮（TN）含量高的特点，在处理过程中，大部分转化为稳定的硝酸盐氮。本实验室在研究城市污水处理反应器［1－2］的同时，研究了城市污水的硝酸盐氮检测方法，针对处理后的城市污水中硝酸盐氮含量高的特点，引入反相高效液相色谱法（RP－HPLC），该方法被成功地应用到了城市污水的检测中，目前这项应用还未见报道。在此基础上，我们继续做了RP－HPLC和麝香草酚分光光度法［3］检测城市污水中硝酸盐氮的方法比较。

检测水中硝酸盐氮的方法很多［4－6］，目前常用的有分光光度法（如酚二磺酸分光光度法［7］、麝香草酚法［3］和双波长的紫外分光光度法［8］）、光谱法（如气相分子吸收光谱法［9］）、色谱法（如离子色谱法［10］、反相高效液相色谱法［11］、离子对色谱法［12］和毛细管电泳法［13］）等。随着检测手段的进步，很多大型仪器逐渐普及，成为实验室常用检测手段，相对于传统检测方法更具高效性，有逐步取代分光光度法的趋势。

但是传统方法经过多年的使用，有的已经成为国家标准，有的得到了大家的普遍认可，因此使用仪器检测结果的可靠性需要进一步确认，这方面的工作已经得到人们的重视，如测定过氧化氢［14］和猪苓多糖［15］的方法比较研究，对于分光光度法与高效液相色谱法的方法比较也见到一些报道，如食品增味剂中麦芽酚［16］、胭脂虫中胭脂红酸［17］、食品中的糖精钠［18］和薇菜中黄酮［19］的检测方法比较，以及在水质分析中总氮检测方法的比较研究［20］。

本文以处理后的城市污水为研究对象，研究RP－HPLC和麝香草酚分光光度法（以下简称麝香草酚法）检测硝酸盐氮的方法对比试验，针对不同的实验条件和要求给出了建设性的建议。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

安捷伦（Agilent）HPLC 1100高效液相色谱仪：自动进样器，十八烷基键合固定相（ODS）反相色谱柱，二极管阵列检测器（DAD），Agilent ChemStation；

流动相缓冲溶液母液：磷酸二氢钾2.381 6g，加水溶解，转移至250mL容量瓶中，加约0.143mL浓磷酸，定容；

上海光谱（Spectrum Shanghai）721E型可见分光光度计；

上海精科雷磁PHS－3CpH计；

麝香草酚（百里酚）乙醇溶液（5g·L－1）；

氨基磺酸胺溶液（20g·L－1）：称取2g氨基磺酸铵，用1＋4乙酸溶液溶解并稀释为100mL；

硫酸银硫酸溶液（10g·L－1）：称取1.0g硫酸银溶于100mL浓硫酸中，摇匀；

国药硝态氮标准储备溶液（100mg·L－1），4℃保存；

试验用水均为超纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯；

水样来自本实验室的微压内循环微生物城市污水处理反应器处理的城市污水。

1.2 RP－HPLC检测城市污水中的硝酸盐氮

取流动相缓冲溶液母液25mL稀释至1 000mL，得流动相A（pH＝3.3）。

流动相为乙腈：A＝8∶92（V／V）；流速0.8mL· min－1；色谱柱温度30℃；进样量10μL；二极管阵列检测器检测波长208nm。记录硝酸盐氮的色谱峰对应的峰面积（A1）。

1.3 麝香草酚法检测城市污水中的硝酸盐氮

（1）取水样适量加入25mL具塞比色管，加水至1mL；

（2）加入0.1mL氨基磺酸氨，混匀，放置5min；

（3）加入0.2mL麝香草酚（中央加入），2.0mL硫酸银硫酸溶液，混匀，放置5min；

（4）加入8.0mL水，混匀；

（5）加入浓氨水9mL至溶液呈现黄色；

（6）加水至25mL，混匀；

（7）在420nm下进行分光光度检测，记录相应的吸光度（A2）。

1.4 样品前处理

对于有固体杂质或浑浊的水样应先用滤纸过滤，否则无需过滤。

过滤后的水样可用于麝香草酚法的检测；而RP－HPLC检测的水样应进一步进行微孔过滤，再进行RP－HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

RP－HPLC和麝香草酚法的检测实质都是共轭化合物在紫外—可见光区发生了共轭电子的跃迁，使其产生一定的吸光度，但检测的目标物和定量的依据不同。

RP－HPLC检测硝酸盐氮时，首先将水样在色谱柱上实现混合组分的一一分离，接下来关注其中硝酸根的响应值。硝酸盐氮在溶液中以硝酸根离子的形式存在，由于硝酸根离子中存在共轭键∏64，因此在近紫外区（200～400nm）有吸收。因此在RPHPLC检测硝酸盐氮时，不需要考虑屏蔽干扰离子的问题。

在浓硫酸存在下，麝香草酚与硝酸盐生成硝基酚化合物，在碱性溶液（浓氨水）中发生分子重排，产生黄色化合物，该物质在可见光区（400～700nm）有吸收。由于水样中存在多种物质，为了防止其他成分生成的化合物干扰硝基酚化合物的可见光吸收，因此加入氨基磺酸铵消除亚硝态氮的干扰，加入硫酸银消除氯离子的干扰。

通过原理对比可以发现，RP－HPLC和麝香草酚法检测城市污水中的硝酸盐氮有本质的区别。RP－HPLC的检测已经排除了杂质的干扰，而麝香草酚法需要通过掩蔽剂来消除干扰。还可以发现RP－HPLC是直接检测硝酸根离子的，而麝香草酚法是先将硝酸根离子衍生化为硝基酚，在碱性条件下使其形成最大的共轭体系，产生更强的吸收，导致2种方法的检测波长不同。

2.2 标准曲线的制作

2.2.1 RP－HPLC的标准曲线制作

将2.0、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0mg·L－1的6个不同质量浓度的硝态氮标准溶液按“1.2”的方法进行RP－HPLC分析，保留时间为1.745min，以色谱峰面积（A1）对质量浓度（c1）做标准曲线（如图1）。

图1 RP－HPLC检测硝酸盐氮的标准曲线

2.2.2 麝香草酚法标准曲线的制作

分别取10.0mg·L－1硝态氮标准溶液0、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70和1.0mL按照“1.3”的方法进行分析，以吸光度（A2）对质量浓度（c2）做标准曲线（如图2）。

图2 麝香草酚法检测硝酸盐氮的标准曲线

2.2.3 标准曲线的相关问题探讨

将2种硝酸盐氮分析方法的标准曲线及相关数（见表1）进行对比，发现二者的线性范围差距较据大，但有交叉，RP－HPLC的范围宽，而麝香草酚法的范围小，原因见“2.1检测原理”。当样品质量浓度在10.00～25.00mg·L－1的样品，采用前者检测不需要稀释，这不仅可以减少操作步骤，节省检测时间，还能降低结果的误差。针对处理后的城市污水中硝酸盐氮含量高的特点，RP－HPLC更有优势。

尽管线性相关性（R2）有差异，但在城市污水的硝酸盐氮检测中（不是微量和痕量分析），对于结果的准确性并没有决定性的影响，因此这项不需要在方法选择时作为主要因素。为了检测更高质量浓度的硝酸盐氮水样，将RP－HPLC标准曲线的检测上限质量浓度进一步扩大到30.00mg·L－1，相关系数下降为0.994，这体现了二极管阵列检测器的缺点，当样品质量浓度继续扩大时，响应值（A1）相对降低，呈现出上凸曲线。在分析方法中，线性范围和线性相关系数是一对矛盾，二者不能兼顾。

表1 标准曲线及相关数据

2.2.4 检出限的对比研究

RP－HPLC和麝香草酚法的检出限（见表1）分别为0.001和0.12mg·L－1，2种方法相差120倍。

2.3 城市污水分析结果对比

取城市污水处理后的水样8份，分别进行RPHPLC（见图3，保留时间tR为1.745min）和分光光度法的检测，并对检测结果进行对比研究（见表2）。

每个样品做2次平行样检测，计算平行偏差（见式（1））。

图3 RP－HPLC分析处理后的城市污水色谱图

表2 水样的检测数据比较

式中：A（平行1）和A（平行2）为同一样品的平行样检测值，RP－HPLC为峰面积，麝香草酚法为吸光度；¯A为平行样检测值的平均值。

RP－HPLC的样品平行偏差在0.01%～0.33%之间，麝香草酚法在0.83%～12%之间，前者的方法稳定性明显更好，检测结果的重现性更好。

2种方法的对比偏差在－6.3%～8.3%之间，这需要进一步研究确定二者的准确性。

2.4 检测成本的对比

进行1个样次的检测，RP－HPLC需要3min，而麝香草酚法通常需要15min。在实际的样品检测中，通常是批量检测，但在核算时间成本时，不能做简单的累加。按连续进行10个样次比较，RPHPLC平均每个样次需要4min，而麝香草酚法需要6min。且在检测过程中，RP－HPLC为全自动分析，而麝香草酚法则需要试验人员不断地加药、测试和记录数据，时间成本与操作者的熟练程度有很大关系，本试验的操作者已经对麝香草酚法非常熟悉，平均每个样次还需要6min，显然后者的时间成本更高。

从试剂消耗的角度分析（见表3），对100个样次做核算，二者需要的药品种类和数量都有显著差异，RP－HPLC只需要3种药品，且用量均不大，显然该方法更环保，更符合绿色化学的理念。

两种方法对样品量的要求也有很大差异，RPHPLC需要0.5mL（只进样10μL），而麝香草酚法需要1.00mL。这同时也决定了标准品用量的不同，影响了试验成本。

表3 100样次检测使用试剂消耗比较

3 结语

本文研究了高质量浓度硝酸盐氮含量的水样的检测方法的对比，通过RP－HPLC和麝香草酚法的对比试验，确定了RP－HPLC在检测范围、检出限，平行偏差、试剂消耗、样品用量和检测时间这些方面都具有优势，给硝酸盐氮检测方法的选择提供了参考。

RP－HPLC具有更宽的检测范围，更高的自动化程度，更低的检出限，可实现完全自动化的分析。通过检测结果的对比，RP－HPLC可以给出更可靠的结果。而分光光度法使用的仪器已被广泛推广，且经过样品前期的稀释处理，可以弥补线性范围小的缺点，因此在一段时期内，仍会被广泛应用。综合分析，反相高效液相色谱法在检测处理后的城市污水中硝酸盐氮方面更具优势。

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Comparison on nitrate nitrogen by detections of RP－HPLC and thymol UV－Vis spectrophotometry

JI Xiao－na，etc.
（School of Science，Changchun Institute of Technology，Changchun130012，China）

For the municipal sewage after treatment，the detecting experiments of RP－HPLC and Thymol UV－Vis Spectrophotometry have been made，and the comparisons between these two methods have been made on the linear range，detection limit，parallel deviation，method bias，detecting time，reagent consumption，and so on.The result shows：the linear range of RP－HPLC is 2.00～25.00mg·L－1，linear dependent coefficient（R2）is 0.999 93，detection limit is 0.001mg·L－1，the parallel deviation of samples is 0.01%～0.33%，detection time is 4mins，and only three reagents are used.The parallel deviation of Thymol UVVis spectrophotometry is 0.83%～11.84%，detection time is 6mins.When seven reagents are used，the method bias of PR－HPLC is－6.31%～8.27%relative to thymol UV－Vis spectrophotometry.

nitrate nitrogen；RP－HPLC；Thymol UV－Vis Spectrophotometry；municipal sewage

X832

：A

：1009－8984（2014）01－0001－04

10.3969／j.issn.1009－8984.2014.01.001

2013－11－22

国家自然科学基金（51078067）吉林省科技计划项目（20122112）吉林省科技发展计划项目（201205091）吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2013309）

纪晓娜（1977－），女（汉），黑龙江宝清，讲师主要研究污水处理和色谱分析等。

＊通讯作者：边德军