肺腺癌组织学亚型与EGFR突变及临床特征的关系

赵艳秋，刘 杰，刘瑞青，张建波，孙晓楠，王 喻，李醒亚

(1.郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院内科，河南郑州 450008； 2.河南省人民医院介入科，河南郑州 450000；3.郑州大学第一附属医院肿瘤科，河南郑州 450003)

肺癌是全世界癌症相关死亡的最常见病因[1]，其中腺癌作为肺癌中最常见的组织学亚型，无论在男性还是在女性近年来发生率都逐渐增加[2]。肺腺癌组织异质性很大，亚型分类复杂多样，目前其主要的亚型分类标准包括2004年的WHO分类[3]和2011年国际肺癌研究学会、美国胸科学会和欧洲呼吸学会(IASLC/ATS/ERS)联合推出的肺腺癌国际多学科分类新标准[4]。

近年来，许多研究发现表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)突变和肺腺癌的某些特殊亚型相关，如伏壁样为主型腺癌(原来的非黏液性BAC)具有更高的EGFR突变率[5-6]，对EGFR酪氨酸激酶抑制剂也更为敏感[7-8]。另外一些相关研究也发现，EGFR突变与含乳头状和微乳头状亚型成分的腺癌呈正相关[5,9-11]；与此相反，黏液性BAC的EGFR突变率却非常低[12-13]。中国肺腺癌人群具体组织学亚型与EGFR突变状态之间的关系并不十分清楚，需要进一步的系统研究。在本实验中，我们研究的内容主要包括：①结合肺腺癌2004年WHO分类和2011年IASLC/ATS/ERS分类，分析肺腺癌组织学亚型与EGFR突变状态之间的关系；②EGFR突变状态与临床病理特征之间的关系分析。

1 资料与方法

1.1标本来源收集郑州大学附属肿瘤医院2009～2011年确诊的肺腺癌患者标本206例，入组患者均有EGFR突变检测结果。206例患者中女性99例(48.1%)，男性107例(51.9%)，年龄31～81岁，平均年龄58.6岁；非吸烟患者129例(62.6%)，吸烟患者77例(37.4%)；临床分期采用2009年国际抗癌联盟(UICC)公布的修订后的第7版国际肺癌分期法，其中Ⅰ期59例、Ⅱ期35例、Ⅲ期45例、Ⅳ期67例。EGFR突变患者91例(44.2%)，其中19外显子缺失突变39例(18.9%)，21外显子突变52例(25.2%)；穿刺活检标本62例(30.1%)，手术标本144例(69.9%)。入组患者的临床病理特征如表1所示。

1.2方法

1.2.1亚型鉴定 206例患者原始HE切片从医院标本库中重新调阅，经2位高年资的病理医师盲法审阅，重新病理确诊及亚型鉴定，意见不一致的样本重新商讨并达成一致观点。分型标准参考2004年WHO分类系统和2011年IASLC/ATS/ERS分类方法，按照以下两种方式进行评估：①参考2004年WHO分类系统(亚型成分的比例大于10%时认为含有此种亚型成分)，按照是否含有某种组织学亚型成分进行分类(如含腺泡成分组和不含腺泡成分组)；②依据新标准中全面的组织学分型原则，以5%的增量半定量法评估组织学类型，并选择一种作为主要类型，可分为伏壁样生长为主型(以前的非黏液性BAC，LPD)、腺泡样为主型(ACI)、乳头状为主型(PAP)、微小乳头状为主型(MIP)、实体型为主型(SOL)、浸润性黏液腺癌(以前的黏液性BAC，IMA)6型。本研究入组患者中共有144例手术样本，腺癌为139例，其中122例混合性腺癌可参照分型标准重新评估亚型，11例单一亚型腺癌，6例由于分化程度低、组织标本过少等原因不能重新评估亚型，另有5例为其他类型非小细胞肺癌(包括4例腺鳞癌，1例鳞癌)。

1.2.2EGFR突变的检测 采用扩增阻滞突变系统 (amplification refractory mutation system，ARMS)法检测EGFR热点突变基因(19和21外显子)的突变情况，荧光定量PCR的仪器号为：Stratagene Mx30009(德国)。

1.3统计学分析统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，统计分析方法采用卡方检验以及Fisher精确概率法，当P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1临床病理特征与EGFR突变的关系206例入组患者中，EGFR突变率为44.2%(91/206)，其中女性比男性具有更高的突变率(56.6%vs. 32.7%，P=0.001)；不吸烟患者比吸烟患者具有更高的突变率(51.9%vs. 31.2%，P=0.004)；综合分析后发现，女性、不吸烟、腺癌患者的EGFR突变率达57.6%(53/92)。EGFR突变状态与年龄、样本类型(手术样本和活检样本)及疾病分期无关(P>0.05，表1)。

表1EGFR突变与临床病理特征之间的关系

Tab.1 Relationship between EGFR mutation and clinicopathologic characteristics

临床病理特征例数[n(%)]EGFR突变型[n(%)]EGFR野生型[n(%)]χ2P性别 男 女107(51.9)99(48.1)35(32.7)56(56.6)72(67.3)43(43.4)11.8660.001年龄(岁) ≥65 <6563(30.6)143(69.4)29(46.0)62(43.4)34(54.0)81(56.6)0.1270.722吸烟史 有 无77(37.4)129(62.6)24(31.2)67(51.9)53(68.8)62(48.1)8.4340.004分期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ～Ⅳ期94(45.6)112(54.4)43(45.7)44(39.3)51(54.3)68(60.7)0.8740.350穿刺活检62(30.1)26(41.9)36(58.1) 腺癌59(95.2)25(42.4)34(57.6) 非腺癌 3(4.8)1(33.3) 2(66.7)手术标本144(69.9)66(45.8)78(54.2)0.2660.606a 腺癌139(96.5)65(46.8)74(53.2) 亚型可评估122(87.8)59(48.4)63(51.6) 非腺癌 5(3.5)1(20.0) 4(80.0)合计20691(44.2)115(55.8)

a：比较穿刺活检标本与手术标本的EGFR突变状态。

2.2组织学亚型特征及其与EGFR突变状态的关系参考2004年WHO分类，122例混合性腺癌中最常见的组织学亚型成分是腺泡型(ACI，76.2%)，其次是非黏液性BAC(42.6%)、乳头型(PAP，15.6%)、实体型(SOL，5.7%)和黏液性BAC(12.3%)。含有BAC成分的腺癌比不含此类成分的腺癌突变率更高(61.5%vs. 38.6%,P=0.012)，含有PAP成分的腺癌倾向比不含此成分的腺癌突变率高，但差异无统计学意义(P=0.057)；相反，EGFR突变在含黏液性BAC成分的腺癌中比不含此类成分的腺癌突变率低，差异有统计学意义(13.3%vs. 53.3%,P=0.004，表2)。

依照2011年IASLC/ATS/ERS分类，最常见的亚型成分是腺泡样为主型(45.1%，55/122)，其次是伏壁样生长为主型(20.5%，25/122)、乳头状为主型(9.8%，12/122)、浸润性黏液腺癌(9.0%，11/122)、微小乳头状为主型(4.1%，5/122)和实体型为主型(3.3%, 4/122)。乳头状为主型具有较高的EGFR突变率(66.7%)，而浸润性黏液腺癌(27.3%)和实体型为主型(25%)突变率较低。统计学分析发现，乳头状为主型腺癌EGFR突变率比实体型为主型和浸润性黏液腺癌更高，但差异无统计学意义(P=0.057，表3)。

表2腺癌标本中含或不含某种亚型成分与EGFR突变的关系

Tab.2 Relationship between EGFR mutation and histologic subtypes with and without certain components in the resected specimens

分类合计[n(%)]EGFR突变型[n(%)]EGFR野生型[n(%)]χ2PBAC 有 无52(42.6)70(57.4)32(61.5)27(38.6)20(38.5)43(61.4)6.3020.012PAP 有 无19(15.6)103(84.4)13(68.4)46(44.7)6(31.6)57(55.3)3.6260.057ACI 有 无93(76.2)29(23.8)48(51.6)11(37.9)45(48.4)18(62.1)1.6570.198黏液BAC 有 无15(12.3)107(87.7)2(13.3)57(53.3)13(86.7)50(46.7)8.4020.004SOL 有 无 7(5.7)115(94.3)1(14.3)58(50.4)6(85.7)57(49.6)2.1570.142

表3依据2011年IASLC/ATS/ERS新分类法组织亚型与EGFR突变的关系

Tab.3 Relationship between EGFR mutation and histologic subtypes according to new IASLC/ATS/ERS classification method

组织亚型例数[122(100%)]EGFR突变型[59(48.4%)]EGFR野生型[63(51.6%)]P腺泡样为主型55(45.1)23(41.8)32(58.2)伏壁样生长为主型25(20.5)12(48.0)13(52.0)乳头状为主型12(9.8)8(66.7)4(33.3)微小乳头状为主型5(4.1)2(40.0)3(60.0)浸润型黏液腺癌11(9.0)3(27.3)8(72.7)实体性为主型4(3.3)1(25)3(75.0)0.057a

A：分析方法为Fisher确切概率法(乳头状为主型 versus浸润型黏液腺癌+实体性为主型)。

3 讨 论

临床研究发现，亚裔、不吸烟、女性、肺腺癌患者是EGFR-TKI治疗的优势人群[14]。在本研究中，入组患者均为腺癌，总的EGFR突变率为44.2%(91/206)，其在女性(P=0.001)、不吸烟(P=0.004)患者中突变率更高，同时符合女性、不吸烟、腺癌3个特征的患者EGFR突变率达57.6%(53/92)，与既往文献报道一致。

2004年的WHO分类承认，80%～90%的肺腺癌均为混合性腺癌，单纯型腺癌很少见[3]。在最近的几年里，肺癌研究的主要进展大多集中在肺腺癌这一亚型上，人们逐渐发现基于病理学的肺腺癌分类方法已无法适应多学科参与的个体化治疗模式。在此背景下，2011年IASLC/ATS/ERS联合推出了肺腺癌的国际多学科分类新标准[4]。在肺腺癌亚型的研究中，国外有学者发现其与EGFR突变状态密切相关，并认为EGFR突变在非黏液性BAC、乳头状和微乳头状腺癌亚型中发生率更高，而在其他组织学亚型中发生率较低，尤其在黏液性BAC亚型中EGFR突变率更低[5-13]。在本研究中，我们结合2004年WHO分类系统和2011年IASLC/ATS/ERS新分类标准，探讨了国内肺腺癌人群中组织形态学特征能否反映EGFR的突变状态。我们的研究结果进一步证实，含非黏液性BAC成分的腺癌EGFR突变率更高，而含黏液性BAC成分的腺癌EGFR突变率更低；以乳头状为主型腺癌的EGFR突变率高于浸润型黏液腺癌和实体性为主型腺癌。

国外研究发现，与非黏液BAC相比，含乳头状成分的混合型腺癌突变率也很高[9,13]，乳头型常被认为是BAC的进展形式[15]，两者之间的生物学联系和区别还需进一步的研究。在本研究中虽然含乳头状成分的腺癌突变率较高，但差异没有统计学意义(P=0.057)，可能是入组样本数量过少的原因。

关于组织学亚型与EGFR突变之间存在密切联系的真正原因，目前仍不是很清楚。相关基础研究发现，外周型肺腺癌主要起源于终末细支气管的Clara(克拉拉)细胞和肺癌Ⅱ型上皮细胞，在该型腺癌中，甲状腺转录因子-1(TTF-1)的表达常为阳性，位于中央气道的腺癌主要起源于支气管基底细胞和黏液分泌细胞，TTF-1的表达为阴性。层序聚类分析也提示，两个差异的基因簇分别对应终末呼吸单位(TRU)和非终末呼吸单位(N-TRU)来源的腺癌。日本学者YATABE等[6,16]发现，TRU来源的腺癌是一种特别的腺癌类型，与细支气管肺泡癌(BAC)特征非常符合，表现出独特的细胞学形态以及TTF-1和细胞表面蛋白表达。在149例TRU腺癌中，EGFR突变率为61.1%，97例EGFR突变患者中，高达91例(93.8%)为TRU腺癌。TRU腺癌预测EGFR突变具有高的敏感性和特异性，对EGFR-TKI治疗更为有效。

日本学者YOSHIDA等[17]为了研究组织学亚型与EGFR突变间的关系，检测了54例肺不典型腺瘤样增生(肺腺癌的前期病变)的EGFR突变情况，并未发现EGFR突变患者和未突变患者之间存在明显的组织学差异，并且由于不典型腺瘤样增生患者的EGFR突变频率远远低于非黏液性BAC腺癌，作者猜测发生EGFR突变的不典型腺瘤样增生在后来的疾病进展中很可能发展为非黏液性BAC腺癌。SAKUMA 等[18]为了研究EGFR突变和含BAC成分腺癌之间的关系，把114例非小细胞肺癌分为含黏液成分BAC、不含黏液成分BAC和不含BAC成分的腺癌，利用高灵敏度PCR方法检测EGFR和KRAS突变状态。研究发现，非黏液性BAC和黏液性BAC成分同EGFR和KRAS突变状态之间存在着密切的联系，由于88%含非黏液性BAC成分的腺癌都检测到了EGFR突变。作者推断EGFR突变可能是含非黏液性BAC成分的原位肺腺癌发病机制中的关键性事件。

在人类肺癌组织中，TTF-1主要在终末细支气管的Clara(克拉拉)细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞中阳性表达，是肺腺癌的谱系特异性致癌基因，而鳞癌和大细胞癌很少表达[19-20]。有研究发现，TTF-1主要表达在非黏液性肺腺癌中[21]。那么，与肺腺癌组织学特征密切联系的TTF-1表达水平与EGFR突变之间是否存在联系，我们将在随后的研究中进一步探讨。

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