1，25-二羟维生素D3对严重烫伤小鼠应激反应的影响

刘 曼 张明谏 李小兵 刘光晶 王玉亮 张 建 刘 宁

1，25-二羟维生素D3对严重烫伤小鼠应激反应的影响

刘 曼1张明谏2△李小兵2刘光晶2王玉亮3张 建1刘 宁2

目的 探讨1，25-二羟维生素D3[1，25-(OH)2VitD3]对严重烫伤小鼠应激状态下胰岛素抵抗和炎症反应的影响。方法130只小鼠按随机数字表法分为健康组10只，实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、对照组各40只。实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组制成30%全身体表面积（TBSA）Ⅲ度烫伤模型。每隔1日晨8时，实验组Ⅰ小鼠1，25-(OH)2VitD31 μg· kg-1+0.6 mL花生油灌胃；实验组Ⅱ1，25-(OH)2VitD34 μg·kg-1+0.6 mL花生油灌胃；对照组0.6 mL花生油灌胃。分别于伤后1、3、7、14 d测空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FIns）、血清肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度和创面组织核因子（NF）-κB阳性率。结果（1）实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组各时点胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、血清TNF-α水平和创面组织NF-κB表达阳性率均数均高于健康组水平。（2）实验组Ⅰ和实验组Ⅱ伤后同一时点HOMA-IR均低于对照组，且实验组Ⅱ低于实验组Ⅰ（P＜0.05）；同一组内不同时点伤后第3天HOMA-IR均数最高，以后逐渐降低（P＜0.05）。（3）实验组Ⅰ和实验组Ⅱ伤后同一时点血清TNF-α水平、创面组织NF-κB表达阳性率均低于对照组，且实验组Ⅱ低于实验组Ⅰ（P＜0.05）；同一组内不同时点血清TNF-α水平、创面组织NF-κB表达阳性率均逐渐降低（P＜0.05）。结论1，25-(OH)2VitD3能够减轻严重烫伤小鼠应激状态下胰岛素抵抗作用和炎症反应。

骨化三醇；烧伤；胰岛素抵抗；肿瘤坏死因子-α；NF-κB；小鼠；1，25-二羟维生素D3

严重烧伤后机体产生应激反应，常有糖代谢紊乱和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）。同时，机体发生炎症反应生成大量肿瘤坏死因子（TNF）-α，TNF-α可间接激活核因子(NF)-κB，NF-κB激活后又促进TNF-α的表达与释放[1]。有文献报道，血清TNF-α水平和胰岛素抵抗程度呈正相关[2]。1，25-二羟维生素D3[1，25-(OH)2VitD3]可调节钙磷代谢，还有改善胰岛素抵抗和抗炎等作用[3-4]。本研究通过观察1，25-(OH)2VitD3对严重烫伤小鼠胰岛素抵抗指数、血清TNF-α浓度和创面组织NF-κB表达的影响，探讨1，25-(OH)2VitD3对严重烫伤小鼠伤后应激反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 1，25-(OH)2VitD3（Sigma公司，美国），花生油（Spectrum公司，美国），磺胺嘧啶银霜（上海江莱生物科技有限公司）；化学发光法胰岛素定量检测试剂盒（北京北方生物试剂研究所）；小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（RayBiotech公司，美国）；兔抗小鼠NF-κB p50多克隆抗体（南京川博生物技术有限公司），羊抗鼠/兔二抗检测试剂盒、DAB显色试剂盒（上海太阳生物公司），三诺安稳血糖仪、血糖试纸（长沙三诺生物传感技术有限公司）。

1.1.2 实验小鼠分组 选择健康SPF级KM小鼠130只（军事医学科学院实验动物中心），雌雄各半，体质量28～32 g，鼠龄6～8周。按随机数字表法将小鼠分成4组，健康组（不烫伤）10只，实验组Ⅰ（烫伤后用药）、实验组Ⅱ（烫伤后用药）和对照组（烫伤后不用药）各40只。分笼饲养各组，常规动物饲料喂食。

1.1.3 烫伤模型的建立 适应性饲养1周，实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组小鼠背部用6%Na2S脱毛，腹腔注射4%水合氯醛（40 mg·kg-1）麻醉，麻醉成功后脱毛区置于100℃热水12 s，制成30%全身体表面积（TBSA）Ⅲ度烫伤模型（病理切片证实）。伤后立即腹腔注射2 mL·kg-11%TBSA乳酸钠林格液复苏，伤后第2天给予半量。创面涂抹2%磺胺嘧啶银霜抗感染1次/d。

1.1.4 药物干预方法 每隔1日晨8时，给予实验组Ⅰ小鼠1，25-(OH)2VitD31 μg·kg-1+0.6 mL花生油灌胃，给予实验组Ⅱ小鼠1，25-(OH)2VitD34 μg·kg-1+0.6 mL花生油灌胃，给予对照组小鼠0.6 mL花生油灌胃。

1.2 检测方法

1.2.1 标本的采集和制备 小鼠禁食过夜，于晨8时断头处死后取血。健康组小鼠一次处死，实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组小鼠分别于烫伤后1、3、7、14 d各处死10只。小鼠血液离心后收集0.8 mL血清置-80℃保存。同时取创面组织1.0 cm×1.0 cm，用10%中性福尔马林液保存。

1.2.2 空腹血糖（FBG）和空腹胰岛素（FIns）水平测定 每次采血时用血糖仪即时测FBG。用化学发光免疫法检测血清FIns水平。

1.2.3 胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的计算 用稳态模式法（HOMA）计算HOMA-IR，公式为：HOMA-IR=FBG(mmol/L)× FIns(mU/L)/22.5。

1.2.4 小鼠血清TNF-α的水平测定 取出-80℃保存的血清标本于常温放置30 min后，用小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒检测小鼠血清TNF-α的浓度。

1.2.5 免疫组织化学法测创面组织NF-κB阳性率 创面组织标本常规石蜡包埋切片，免疫组化试剂盒染色。NF-κB阳性呈棕黄色颗粒，主要在细胞浆和（或）细胞核中表达。高倍镜下（×400倍）随机读取5个不同的视野，计数100个细胞及阳性细胞数，创面组织NF-κB阳性率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.3 统计学方法 用SPSS 18.0软件进行数据的统计和处理。计量资料均以±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验小鼠不同时点HOMA-IR值的比较 健康组小鼠HOMA-IR均数为4.75±0.48。实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组小鼠伤后不同时点HOMAIR均数均高于健康组水平（实验组Ⅱ第14天与健康组比较，P＞0.05，余与健康组比较均P＜0.05）。同一时点不同组间比较，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠伤后HOMA-IR均数均低于对照组水平，且实验组Ⅱ低于实验组Ⅰ，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1。同一组不同时点比较，烫伤小鼠伤后第3天HOMA-IR均数达最高，以后逐渐降低；同一组内烫伤小鼠伤后不同时点HOMA-IR比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

Table 1 Comparison of HOMA-IR value in different times between three groups of experimental mice表1 各组实验小鼠伤后不同时间HOMA-IR值的比较（n=10±s）

Table 1 Comparison of HOMA-IR value in different times between three groups of experimental mice表1 各组实验小鼠伤后不同时间HOMA-IR值的比较（n=10±s）

＊＊P＜0.01；F1：同组不同时点比较，F2：同一时点不同组间比较；各组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；表2、3同

组别实验组Ⅰ实验组Ⅱ对照组F1 29.196＊＊28.476＊＊116.260＊＊F2第1天7.04±0.43 6.03±0.61 10.52±0.56 204.165＊＊第3天7.76±1.04 6.77±0.50 11.32±0.86 105.470＊＊第7天6.03±0.34 5.29±0.47 8.48±0.46 244.276＊＊第14天5.41±0.36 4.80±0.47 6.65±0.51 43.843＊＊

2.2 各组实验小鼠不同时点血清TNF-α水平的比较 健康组小鼠血清TNF-α水平为（364.10±46.13）ng/L。实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组小鼠伤后不同时点血清TNF-α水平均数均高于健康组水平，实验组Ⅱ小鼠伤后第14天血清TNF-α水平均数接近于健康组水平（实验组Ⅱ第14天与健康组比较，P＞0.05；余与健康组比较，P＜0.05）。同一时点不同组间比较，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠伤后血清TNF-α水平均低于对照组水平，且实验组Ⅱ低于实验组Ⅰ；同一时点各组实验小鼠伤后血清TNF-α水平两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。同一组不同时点比较，烫伤小鼠伤后血清TNF-α水平第1天最高，以后逐渐降低；同一组内烫伤小鼠伤后不同时点血清TNF-α水平比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

Table 2 Comparison of serum TNF-α levels in different times between three groups of experimental mice表2 各组实验小鼠伤后不同时间血清TNF-α水平的比较（n=10，ng/L±s）

Table 2 Comparison of serum TNF-α levels in different times between three groups of experimental mice表2 各组实验小鼠伤后不同时间血清TNF-α水平的比较（n=10，ng/L±s）

组别实验组Ⅰ实验组Ⅱ对照组F2第7天602.30±125.90 483.85±84.45 723.30±118.81 11.592＊＊第14天491.40±106.02 377.75±67.77 618.50±156.98 10.751＊＊F1 14.257＊＊25.538＊＊15.381＊＊组别实验组Ⅰ实验组Ⅱ对照组F2第1天828.15±97.56 717.25±76.90 927.55±45.84 18.938＊＊第3天713.10±148.87 583.45±123.04 829.20±73.55 10.615＊＊

2.3 各组实验小鼠创面组织NF-κB免疫组织化学染色结果 见表3。健康组小鼠皮肤组织NF-κB表达的阳性率为（13.67±6.28）%。实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和对照组小鼠伤后不同时点创面组织NF-κB表达的阳性率均高于健康组水平，实验组Ⅱ小鼠伤后第7天创面组织NF-κB表达的阳性率接近于健康组水平（实验组Ⅱ第7天与健康组比较，P＞0.05；余与健康组比较，P＜0.05）。同一时点不同组间比较，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠伤后创面组织NF-κB表达的阳性率均低于对照组，且实验组Ⅱ低于实验组Ⅰ，差异均有统计学意义（P＜0.05）。同一组不同时点比较，烫伤小鼠伤后创面组织NF-κB表达阳性率均为第1天最高，以后逐渐降低；同一组内烫伤小鼠伤后不同时点创面组织NF-κB表达阳性率差异均有统计学意义(P＜0.05)。烫伤后3 d各组创面组织NF-κB的表达情况见图1。

Table 3 Comparison of the positive expression rate(%) of NF-κB in wound tissues between three groups of experimental mice at different times表3 各组实验小鼠伤后不同时间创面组织中NF-κB表达的阳性率比较 （n=10，%±s）

Table 3 Comparison of the positive expression rate(%) of NF-κB in wound tissues between three groups of experimental mice at different times表3 各组实验小鼠伤后不同时间创面组织中NF-κB表达的阳性率比较 （n=10，%±s）

组别实验组Ⅰ实验组Ⅱ对照组F2第1天68.10±12.16 55.02±12.04 79.68±12.10 12.643＊＊第3天53.11±14.01 30.18±9.64 69.49±8.65 32.131＊＊第7天30.13±11.77 15.87±6.28 62.54±12.31 52.076＊＊F1 22.737＊＊42.413＊＊5.977＊＊

Figure 1 The expression of NF-κB in scalded tissue at the 3th day after burn injury（DAB,×400）图1 烫伤后3 d NF-κB在各组创面组织中的表达（DAB,×400）

3 讨论

严重烧伤后机体发生应激反应，陈新龙等[5]通过正常血糖高胰岛素葡萄糖钳夹实验证实，严重烧伤后机体处于高分解状态，对胰岛素的敏感性下降，组织细胞糖代谢异常，产生胰岛素抵抗。此时，机体血糖升高，加重伤后机体的代谢紊乱，加重创面感染和多器官功能障碍等[6]。烧伤后早期炎症反应也是应激反应的组成部分。减轻严重烧伤后胰岛素抵抗和早期炎症反应可减轻烧伤后机体应激反应。

维生素D主要来自膳食营养，部分由皮肤合成。严重烧伤后，膳食摄入量减少限制维生素D的摄入，正常皮肤的毁损影响维生素D的合成。维生素D在体内经过25-羟基化和1-α羟基化后成为1，25-(OH)2VitD3，从而发挥其生物学的作用[7]。1，25-(OH)2VitD3主要作用是维持血清钙磷浓度的稳定，还可调节胰岛素的敏感性、减轻炎症反应等[3-4]。

1，25-(OH)2VitD3可直接抑制过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)-γ的表达，并抑制3T3-L1前脂肪细胞分化为脂肪细胞，从而发挥其抗脂肪形成的作用；亦能够直接激活PPAR-δ，调节脂肪组织和骨骼肌中的脂肪酸代谢，改善胰岛素抵抗[8-9]。本实验结果表明，严重烫伤小鼠伤后产生应激反应，血糖升高，引起胰岛素抵抗，伤后第3天达高峰，以后逐渐降低。隔日分别给予实验组Ⅰ和实验组Ⅱ烫伤小鼠1，25-(OH)2VitD31 μg·kg-1和4 μg·kg-1后，2组伤后HOMA-IR均较对照组低，且实验组Ⅱ较实验组Ⅰ低。表明1，25-(OH)2VitD3可改善严重烧伤引起的胰岛素抵抗反应。

巨噬细胞可产生TNF-α、白细胞介素（IL）-6及NO等炎性因子，它可表达维生素D受体（VDR），亦可表达维生素D-25-羟化酶和1α-羟化酶，能够催化维生素D成为1，25-(OH)2VitD3，1，25-(OH)2VitD3可抑制炎性因子分泌，从而发挥抗炎作用[10]。本实验结果显示，小鼠血清TNF-α水平和创面组织NF-κB表达阳性率升高。隔日分别给予实验组Ⅰ和实验组Ⅱ烫伤小鼠1，25-(OH)2VitD31 μg·kg-1和4 μg· kg-1后，2组伤后血清TNF-α水平和创面组织NF-κB表达阳性率均较对照组低，且实验组Ⅱ较实验组Ⅰ低。严重烫伤后第3天实验小鼠胰岛素抵抗达高峰，此时创面组织NF-κB表达也明显升高，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ创面组织NF-κB表达低于对照组，且实验组Ⅱ表达率低于实验组Ⅰ，三者均高于健康组水平。表明1，25-(OH)2VitD3可减轻严重烧伤后的炎症反应。维生素D3亦可降低应激机体C-反应蛋白（CRP）的水平，从而减轻其激活补体引起的炎性反应，进而说明这一点。

总之，严重烫伤小鼠伤后给予1，25-(OH)2VitD3灌胃可以减轻胰岛素抵抗，降低血清TNF-α水平和创面组织NF-κB表达阳性率，提示1，25-(OH)2VitD3可以减轻严重烧伤小鼠伤后应激反应，1，25-(OH)2VitD3适宜补充剂量有待深入研究。

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（2013-10-15收稿 2014-01-15修回）

（本文编辑 魏杰）

Effect of 1,25-Dihydroxyvitamin D3on Alleviating the Stress Response in Severely Scalded Mice

LIU Man1,ZHANG Mingjian2,LI Xiaobing2,LIU Guangjing2,WANG Yuliang3,ZHANG Jian1,LIU Ning2
1 The First Central Clinical College of Tianjin Medical University,Tianjin 300192,China;2 Department of Plastic and Burn, The First Center Hospital of Tianjin;3 The Key Laboratory of Critical Care of Medicine Ministry of Health

ObjectiveTo explore the effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3[1,25-(OH)2VitD3]on insulin resistance and inflammatory response in mice with severe burns under stress.MethodsOne hundred and thirty mice were randomly divided into healthy group(n=10),experimental groupⅠ(n=40),experimental groupⅡ(n=40)and control group(n= 40).The model mice were scalded to 30%of total body surface area(TBSA)burnt(Ⅲ°)in experimental groupⅠ,the experimental groupⅡand control group.Mice in experimental groupⅠwere given by gavaging 1,25-(OH)2VitD3(1 μg·kg-1)with 0.6 mL peanut oil at 8 am for every other day.At the same time and by the same way,mice in experimental groupⅡ

1,25-(OH)2VitD3(4 μg·kg-1)with 0.6 mL peanut oil,and mice in control group received only 0.6 mL peanut oil.The serum levels of fasting blood glucose(FBG),fasting insulin(FIns),TNF-α concentration,and the NF-κB positive rate in wound tissues were determined respectively on day1,day3,day7 and day14 after burn.Results(1)The values of insulin resistance index(HOMA-IR),serum TNF-α and the NF-κB positive rate in wound tissues were higher at different time points in experimental groupⅠ,experimental groupⅡand control group than those in healthy group.(2)The levels of HOMA-IR at the same time points were significantly lower in experimental groupⅠand experimental groupⅡthan those in control group,and the value was significantly lower in experimental groupⅡthan that of experimental groupⅠ(P＜0.05).The level of HOMAIR was the highest at day 3 and then gradually decreased at the different time points in the same group(P＜0.05).(3)The serum levels of TNF-α and NF-κB positive rate of wound tissues at the same time points were significantly lower in experimental groupⅠand experimental groupⅡthan those in control group,and the value was significantly lower in experimental groupⅡthan that of experimental groupⅠ(P＜0.05).The serum level of TNF-α and NF-κB positive rate of wound tissues were gradually decreased at the different time points in same group(P＜0.05).Conclusion1,25-(OH)2VitD3can reduce the insulin resistance and inflammatory response in mice with severe burns under stress.

calcitriol;burns;insulin resistance;tumor necrosis factor-alpha;NF-kappa B;mice;1,25-dihydroxyvitamin D3

R644

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.05.014

1天津医科大学一中心临床学院（邮编300192）；2天津市第一中心医院整形与烧伤外科；3卫生部危重病急救医学重点实验室

△通讯作者 E-mail:zhangmingjian@hotmail.com