新型香豆素二氢吡唑硫代乙酮衍生物的合成及其抗肿瘤活性*

吴小琼，张贤，薛伟，刘新华

(1.安顺职业技术学院，贵州 安顺 561000;2.贵州大学精细化工研究开发中心，贵州 贵阳 550025)

新型香豆素二氢吡唑硫代乙酮衍生物的合成及其抗肿瘤活性*

吴小琼1，张贤2，薛伟2，刘新华2

(1.安顺职业技术学院，贵州 安顺 561000;2.贵州大学精细化工研究开发中心，贵州 贵阳 550025)

以3-乙酰基-6-香豆素为起始原料，设计并合成了一系列新型香豆素二氢吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g)，其结构经1H NMR和元素分析表征。初步体外生物活性测定结果表明:丁硫基乙酰三氟甲基苯基香豆素二氢吡唑(6a)和丙硫基乙酰苯基香豆素二氢吡唑(6f)对癌细胞SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2具有较高的抑制增殖活性。用改进的TRAP法测试了6a，6e和6f的端粒酶活性，其中6f具有很强的抑制活性，其IC50为(1.27±0.18)μM。

香豆素;二氢吡唑;药物设计;合成;抗癌活性;端粒酶活性

端粒酶是一种肿瘤标志物，已成为抗肿瘤药物筛选的新靶点［1-2］。端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚甲基，这种催化酶是端粒酶活性的关键。目前，靶向端粒酶的抗肿瘤治疗有两种策略:一是直接通过抑制端粒酶的催化亚基活性(hTERT)或其RNA模板，从而抑制端粒酶活性。另一种是间接抑制端粒酶亚单位与G-四链体稳定剂，端粒聚合酶或HSP90抑制剂的结合［3-4］。最近，一些优良抗癌效果的端粒酶逆转录酶抑制剂被报道，如BIBR15324，但这些抑制剂的选择性不高，对人体正常细胞毒性较大。因此，发现并合成高效、高选择性端粒酶抑制剂是抗癌药物发展的迫切需要。

3，4-二氢吡唑衍生物具有多种生物活性［5-7］。本课题组曾报道［8］过类似化合物的合成及其抗肿瘤活性，尤其是基于端粒酶靶标的新型3，4-二氢吡唑衍生物的设计、合成及构效关系。研究结果表明:当在3，4-二氢吡唑骨架上接入香豆素基团时可得到具有更高抗肿瘤活性的化合物。

本课题组通过计算机虚拟筛选，已经确定了高电子密度的香豆素环上方的活性空间。与此同时也发现了一种基于hTERT(3DU6)晶体结构的小分子抑制剂的复合物结构。由于得到了结合部位的结构信息，可以利用分子模拟与现有的数据相结合指导目标化合物的设计，以便更有效地进行绑定，从而增加药物的效力。为此，对计算机生成二氢吡唑香豆素硫代乙酮与hTERT的活性位点的分子对接模型进行了分析。引入三氟甲基便形成一个卤键，苯基二氢吡唑环固定到一个更稳定的疏水区，加强了端粒酶抑制活性。我们也注意到活性位点附近的亲水性作用的重要性，以及该基团的关键位置(硫酮)在溶剂的暴露区域的结合位点，同时，芳香环的平面疏水基团可以结合的疏水性空腔的面积，所以，在设计中用带环的化合物作为S部分的取代基团。基于以上分析，且少有文献系统报道上述骨架的设计合成，为了寻找并发现新的具有抗癌活性高效端粒酶抑制剂，本文设计并合成了一系列新型三氟甲基苯基硫代乙酮二氢吡唑香豆素。

本文以3-乙酰基-6-香豆素(1)为起始原料，与2-三氟甲基苯(2a)［或苯(2f)］经克莱森缩合反应制得6-氯香豆素-取代苯基-α，β-不饱和酮(3a，3f);3与硫醇经SN2反应制得3-［1-(2-溴乙酰基)-5-取代苯基-4，5-二氢吡唑-6-氯香豆素(4a，4f);4与取代硫醇(5a～5g)经取代反应合成了7个新型的香豆素二氢吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g，Scheme 1)，其结构经1H NMR和元素分析表征。测定了6a～6g对SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2的体外抗肿瘤活性。并用改进的TRAP法测试了6a，6e和6f的端粒酶活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-4型显微熔点仪(温度未校正);400 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标);Elementar Vario-III型元素分析仪;BioRad 550型酶标仪。

1，3和4参考文献［8］方法合成;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 6a～6g的合成(以6a为例)

在反应瓶中加入4a 10 mmol和氯仿20 mL，搅拌使其溶解;加入叔丁基硫醇(5a)10 mmol，KHCO38 mmol和催化剂KI 0.1 g，于40℃～50℃反应3 h。冷却至室温，加少量水，静置沉淀;过滤，滤饼经二氧化硅柱色谱［洗脱剂:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=68∶1］纯化得无色晶体6a。

用类似的方法合成无色晶体6b～6g。

6a:收率75%，m.p.176℃～177℃;1H NMR δ:0.88(t，J=8.0 Hz，3H，CH3)，1.32(m，2H，CH2in Bu)，1.55(m，2H，CH2in Bu)，2.67(t，J=4.0 Hz，2H，6-H)，3.17(dd，J=20.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.77(m，2H，6-H)，3.93 (dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.75 (dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.17～7.58(m，7H，ArH)，8.65(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C25H22N2O3SF3Cl:C 57.42，H 4.24，N 5.36;found C 57.75，H 3.93，N 5.69。

6b:收率68%，m.p.143℃～145℃;1H NMR δ:3.18(dd，J=4.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Ha)，3.75～3.90(m，2H，6-H)，4.00(dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.85(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，6.30～6.47(m，2H，3″，4″-H)，7.22～7.60(m，8H，ArH，5″-H)，8.61(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C25H16N2O4SF3Cl:C 57.09，H 3.32，N 5.12;found C 56.71，H 3.29，N 5.40。

6c:收率77%，m.p.147℃～148℃;1H NMR δ:3.12(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.92(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.18～4.49(m，2H，6-H)，5.72(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.10(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，7.28～7.46(m，9H，ArH)，7.71(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，8.63(s，1H，4'-H); Anal.calcd for C27H17N2O3SF3ClBr:C 52.15，H 2.76，N 4.50;found C 51.87，H 3.03，N 4.81。

6d:收率69%，m.p.150℃～151℃;1H NMR δ:3.16(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，4.05(dd，J=18.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.09～4.34(m，2H，6-H)，5.65(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.11～7.71(m，10H，ArH)，8.00(d，J=8.0 Hz，1H，ArH)，8.61(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C27H17N3O5SF3Cl:C 55.16，H 2.91，N 7.15;found C 54.87;H 3.09，N 7.48。

6e:收率63%，m.p.165℃～167℃;1H NMR δ:3.15(dd，J=18.0 Hz，1H，4-Ha)，4.05(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.33～4.79 (m，2H，6-H)，5.77(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz， 1H，5-H)，7.16～7.47(m，7H，ArH)，7.85(d，J=4.0 Hz，1H，ArH)，8.69(d，3H，4'-H，Py-H);Anal.calcd for C25H16N4O3SF3Cl:C 55.10，H 2.96，N 10.28;found C 55.35，H 3.14，N 9.89。

6f:收率72%，m.p.175℃～176℃;1H NMR δ:0.90(t，J=8.0 Hz，3H，CH3in Pr)，1.61～2.53(m，4H，CH2in Pr)，3.15(dd，J=20.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.70(m，2H，6-H)，3.87 (dd，J=12.0 Hz，20.0 Hz，1H，4-Hb)，5.71 (dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，7.09～7.35(m，8H，ArH)，8.64(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C23H21N2O3SCl:C 62.65，H 4.80，N 6.35;found C 63.02，H 5.11，N 5.95。

6g:收率67%，m.p.149℃～151℃;1H NMR δ:3.13(dd，J=18.0 Hz，4.0 Hz，1H，4-Ha)，3.90(dd，J=20.0 Hz，12.0 Hz，1H，4-Hb)，4.10～4.43(m，2H，6-H)，5.65(dd，J=12.0 Hz，4.0 Hz，1H，5-H)，6.97～7.41(m，13H，ArH)，8.63(s，1H，4'-H);Anal.calcd for C26H19N2O3SCl:C 65.75，H 4.03，N 5.90;found C 66.01，H 4.27，N 5.62。

1.3 活性测试

［8］方法测定6a～6g和5-Fu的抗癌活性和端粒酶活性。

2 结果与讨论

2.1 抗癌活性

以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为阳性对照，考察了6a～6f对SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2的细胞毒活性，实验结果见表1。从表1可见，6a和6f对SGC-7901和MGC-803表现出较好的细胞毒活性，而且超过了5-Fu的细胞毒活性。6f对Bcap-37抗癌活性也要比5-Fu强，其IC50为(4.59±0.77)μM。

从表1的活性数据可以得出以下结论:6a～6g可以分为两类，即在硫原子的末端含有直链取代基化合物(6a，6f)和环状取代的化合物(6b，6c，6d)，其中6a和6f对SGC-7901，HepG-2，Bcap-37和MGC-803细胞系表现出较为明显的抗癌活性，而大多数其它环状取代基团的化合物对上述细胞系只表现出中强度的抗癌活性。

表1 6a～6g的体外抗癌活性aTab le 1 Anticancer activities of 6a～6g in vitro

表2 6a，6e和6f对端粒酶抑制活性Table 2 The inhibitory activities of 6a，6e and 6f on telomerase

2.2 端粒酶活性

以MGC-803为研究对象，从中提取出了端粒酶，并选用溴化乙锭和BIBR1532作为对照测试了6a，6e和6f对端粒酶的抑制作用，实验结果见表2。从表2可见，6f对端粒酶表现出很强的抑制活性，其IC50为(1.27±0.18)μM。表1和表2数据表明:6f的抗增殖活性和端粒酶活性之间具有良好的相关性，初步说明6f是通过抑制端粒酶而抑制癌细胞生长的，表现出比其它化合物更高的抑制活性。三氟甲基可能具有局部偶极矩匹配结合的位点，使偶极矩的方向相反，导致较高的活性。这也为我们进一步优化具有抗癌活性以作为潜在的端粒酶抑制剂的二氢吡唑结构指出了方向。

3 结论

设计并合成了7个新型的香豆素二氢吡唑硫代乙酮衍生物(6a～6g)。初步体外生物活性测定结果表明:丁硫基乙酰三氟甲基苯基香豆素二氢吡唑(6a)和丙硫基乙酰苯基香豆素二氢吡唑(6f)对癌细胞SGC-7901，MGC-803，Bcap-37和HepG-2具有较高的抑制增殖活性。6f对端粒酶具有很强的抑制活性，其IC50为(1.27±0.18)μM。

参考文献

［1］Corey D R.Telomeres and telomerase:From discovery to clinical trials［J］.Chem Biol，2009，16:1219-1223.

［2］Ding Z，Wu C J，Jaskelioff M，et al.Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases［J］.Cell，2012，148(5):896-907.

［3］Harley C B.Telomerase and cancer therapeutics［J］.Nat Rev Cancer，2008，8(3):167-179.

［4］Shay JW，Keith W N.Targeting telomerase for cancer therapeutics［J］.Br JCancer，2008，98(4):677-683.

［5］刘新华，白林山，王世范.5-(2-羟基苯基)-3-甲基吡唑酰胺衍生物的合成与杀菌活性［J］.合成化学，2006，14(2):147-149.

［6］刘新华，白林山，王世范.新型吡唑硫代酰胺衍生物的合成与杀菌活性［J］.合成化学，2006，14(3): 272-275.

［7］白林山，刘会峰，刘新华.新型色酮衍生物的设计合成与抗癌活性［J］.合成化学，2010，18(6): 671-674.

［8］Liu X H，Li J，Shi JB，etal.Design and Synthesis of novel 5-phenyl-N-piperidine ethanone containing 4，5-dihydropyrazole derivatives as potential antitumor agents［J］.European Journal of Medicinal Chemistry，2012，51(3):294-299.

Synthesis and Anticancer Activities of Novel Coumarin-dihydropyrazole Thio-ethanone Derivatives

WU Xiao-qiong1，ZHANG Xian2，XUEWei2，LIU Xin-hua2
(1.Anshun Professional Technology Institute，Anshun 561000，China; 2.Center for Research and Development of Fine Chemicals，Guizhou University，Guiyang 550025，China)

A series novel coumarin-dihydropyrazole thio-ethanone derivativeswere designed and synthesized from 3-acetyl-6-coumarin.The structureswere characterized by1H NMR and elemental analysis.The preliminary in vitro biological activities tests showed that［(butylthio)acetyl］-5-［2-(trifluoromethyl)phenyl］-dihydropyrazole(6a)and［(propylthio)acetyl］-5-［2-(trifluoromethyl)phenyl］-dihydropyrazole(6f)exhibited high anticancer activities against SGC-7901，MGC-803，Bcap-37 and HepG-2 cell lines.6a，6e and 6f were tested against telomerase by a modified TRAP assay and 6f showed themost potent inhibitory activity with IC50value of(1.27±0.18)μM.

coumarin;dihydropyrazole;drug molecular design;synthesis;anticancer activity;telomerase activity

O621.3;R914.5

A

1005-1511(2014)02-0164-04

2013-09-09;

2013-11-12

国家自然科学基金资助项目(21272008)

吴小琼(1967-)，女，汉族，贵州安顺人，副教授，主要从事有机化学的研究。

刘新华，博士，教授，博士生导师，E-mail:xhliuhx@163.com