髓性白血病骨髓单个核细胞表面CD40、CD40L的表达及其意义

冯永怀，吴柳松，方宁，冯子芳，陈琦

(遵义医学院附属医院血液内科，贵州遵义 563003)

髓性白血病骨髓单个核细胞表面CD40、CD40L的表达及其意义

冯永怀，吴柳松，方宁，冯子芳，陈琦

(遵义医学院附属医院血液内科，贵州遵义 563003)

目的研究共刺激分子CD40、CD40L在人急、慢性髓性白血病治疗前后骨髓单个核细胞表面的表达特点，探讨其与临床疗效的关系。方法应用免疫荧光标记及流式细胞术(FACS)检测了37例急性髓性白血病及20例慢性髓性白血病患者治疗前后骨髓单个核细胞表面共刺激分子CD40、CD40L的表达。另取8例健康人骨髓作为正常对照组。结果①治疗前急性髓性白血病(AML)患者中，除急性早幼粒细胞白血病(M 3)外，CD40表达均低于正常对照组(P＜0.05)；②治疗后完全缓解(CR)和部分缓解(PR)患者CD40较其治疗前显著增高(P＜0.05)，CR患者接近对照者，而未缓解(NR)患者CD40的表达差异无统计学意义(P＞0.05)；③CD40在慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞上的表达与正常对照差异无统计学意义(P＞0.05)；④所有急、慢性髓性白血病患者及正常对照骨髓单个核细胞上的CD40L均存在表达缺陷，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论CD40是参与急性髓性白血病(AML)发病和抗白血病免疫反应的重要共刺激分子，其表达与白血病分化程度及分型有关，CD40表达异常可能是AML发病机制之一，且与临床疗效密切相关；调节单个核细胞上CD40的表达，纠正AML白血病患者细胞免疫功能缺陷，可能是免疫基因治疗人类急性髓性白血病的重要手段之一，具有一定的临床应用价值。

髓性白血病；单个核细胞表面；CD40；CD40L

CD40-CD40L是继B7-CD28后发现的又一重要的共刺激信号。CD40/CD40L交联可活化NF-KB，进而激活磷酸酪氨酸激酶(PTK)和丝氨酸激酶，促进B细胞存活、增殖、分化。此外，二者交联可增加Fas表达，促进Fas介导的凋亡，上调共刺激因子MHCII、CD58、CD80/CD86的表达，这使得CD40-CD40L参予的双向T-B合作在肿瘤免疫中起着重要作用[1]。本研究应用流式细胞术，检测了临床常见各型白血病骨髓单个核细胞表面共刺激分子CD40、CD40L的表达情况，并与正常健康对照骨髓单个核细胞相比较，以期为sCD40L用于靶向治疗白血病提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料2007年1月至2009年2月遵义医学院附属医院确诊的急性骨髓性白血病(AML)患者(初治或复治)37例(男性16例，女性21例)，中位年龄34(14～68)岁，按FAB分型，并于北京海思特检验中心及我院流式细胞工程室进行免疫分型，其中急性早幼粒细胞白血病(M 3)10例，急性单核细胞白血病(M 5)15例，急性粒细胞白血病部分分化型(M 2)6例，其他类型AML(M-other)6例[(包括急性粒细胞白血病未分化型(M 1)、急性粒单核细胞伴嗜酸性粒细胞增多(M 4EO)、急性巨核细胞性白血病(M 7)各2例)]。均经常规联合化疗，疗效标准依据参考文献[2]。其中，完全缓解(CR)18例，部分缓解(PR)12例，未缓解(NR)7例。慢性粒细胞白血病组(CML)20例初诊慢性期患者，男性12例，女性8例，中位年龄34(24～60)岁，Ph染色体均阳性。正常对照组8例，男性7例，女性1例，中位年龄30(19～35)岁，均为健康自愿者的正常骨髓。

1.2 试剂与仪器用于免疫分型的相关单克隆抗体、PE标记的抗人CD40L单抗、FITC标记的抗人CD40单抗及同型对照购自BD/Pharm ingen公司。流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.3 单个核细胞表面CD40、CD40L的检测采用流式细胞术直接免疫荧光标记法参照此前本研究小组操作方法[3]，上流式细胞仪检测，与对照抗体比较。结果用荧光阈值强度计算阳性细胞百分比。用Facscalibur cellquest软件分析结果。

1.4 统计学方法各组计量资料数据用均值±标准差(x-±s)表示，采用SPSS16.0软件系统进行分析，各组患者与正常对照组的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髓性白血病骨髓单个核细胞CD40、CD40L的表达37例AML及20例CML患者CD40有不同程度的表达，前者与正常对照组相比较，其表达低于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而后者与正常对照组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；所有受测白血病患者与健康志愿者骨髓单个核细胞表面CD40L表达均缺陷，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 髓性白血病骨髓单个核细胞CD40、CD40L的表达(%，±s)

表1 髓性白血病骨髓单个核细胞CD40、CD40L的表达(%，±s)

注：与正常对照组比较，aP＜0.05。

组别AML组CML组正常对照组CD40L 1.057±2.434 1.106±1.667 0.696±0.883例数37 20 8 CD401.549±2.771a3.793±3.220 6.875±4.124

2.2 各型AML骨髓单个核细胞CD40、CD40L的表达对不同类型的AML进行比较，发现M 2、M 5组CD40表达均低于正常对照(P＜0.05)，M 3组CD40存在一定表达，与正常对照组相比较差异无统计学意义(P＞0.05)；M-other组(包括M 1、M 4EO、M 7各2例)其CD40表达低于正常对照(P＜0.05)。CD40L在各型AML的表达均较低，与正常对照组比较差异均无统计学意义，见表2。

表2 各型AM L骨髓单个核细胞CD40、CD154的表达(%，±s)

表2 各型AM L骨髓单个核细胞CD40、CD154的表达(%，±s)

注：与健康对照组比较，aP＜0.05。

组别例数CD40CD40L M 3组M 5组M 2组其他类型AML正常对照组10 15 668 4.1258±2.97 1.555±2.459a0.182±0.153a0.443±0.060a6.875±4.100 1.222±1.127 1.430±0.328 0.628±1.369 0.302±0.319 0.696±0.883

2.3 化疗前后AML骨髓单个核细胞CD40、CD40L的表达治疗后CR和PR患者CD40较其治疗前显著增高(P＜0.05)，CR患者接近对照者，而NR患者CD40的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。CD40L在各组AML中的表达均较低，与正常对照组比较差异均无统计学意义，见表3。

表3 化疗前后AM L骨髓单个核细胞CD40和CD40L的表达(%，±s)

表3 化疗前后AM L骨髓单个核细胞CD40和CD40L的表达(%，±s)

注：与化疗前组比较，aP＜0.05。

组别CR组PR组NR组化疗前组0.687±1.506 0.890±1.089 1.342±1.430 1.057±2.434 18 12 7 37 6.409±2.012a4.024±1.010a1.232±1.706 1.549±2.771 CD40L例数CD40

3 讨论

CD40是NGFR超家族成员，也属于肿瘤坏死家族成员之一，可在多种细胞表达。CD40L即CD40配体，属于TNF超家族成员，与CD40分子相互作用，在肿瘤细胞的抗原呈递、免疫应答反应和细胞的增殖调控方面发挥着重要作用[4]。sCD40L具有抗肿瘤效应，主要是在胃癌、肺癌等实体瘤方面研究较多。Li等[5]研究表明体外培养的胃癌AGS细胞株高表达CD40，利用激发型抗CD40单克隆抗体活化CD40信号可抑制AGS细胞生长、促进细胞凋亡，且显著提高了其对化疗药物的敏感性。陈文学等[6]研究发现sCD40L对高表达CD40信号分子的肺癌A594细胞株的生长有显著地抑制作用，提示sCD40L对高表达CD40分子的肿瘤细胞可能有一定的抗肿瘤作用。此外，sCD40L在血液系统疾病的研究也发现，AML患者化疗后血浆sCD40L水平较化疗前升高[7]。李杰等[8]的研究发现sCD40L可明显抑制急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞的增值，其抗白血病的机制可能与上调CD95、下调BCL-2相关。

研究表明，白血病细胞可能由于存在HLA抗原及协同刺激分子的表达缺陷，而不能激发有效的T细胞应答[9]，而AL患者的白血病细胞常高表达MHC[10]，所以其表面缺乏协同刺激分子的表达可能才是AL产生肿瘤免疫逃逸的主要原因。

关于CD40、CD40L共刺激分子在AL的表达水平，我们的前期研究表明急性淋巴细胞白血病(ALL)单个核细胞表面CD40、CD40L表达缺陷[3]。而急性髓性白血病(AML)各家报道不一，朱芳兵等[11]报道AML中相当一部分存在CD40的阳性表达(37%/52%)，其中M 5的阳性率最高，高于其他AML亚型，并指出AML的临床血液学特征与CD40表达存在相关性。而我们的结果显示在初诊白血病患者的骨髓单个核细胞上，CD40除了在ALL单个核细胞表面表达缺陷[3]，在除了M 3以外的AML表达也都是低于正常对照组。CD40和CD40L表达各家报道不一，除了与各家制定的阳性表达的标准不同，采用的正常对照的标准不同，以及共刺激分子的在标本采集时机不同以外[12]，不同类型或亚型白血病细胞上共刺激分子的表达本身亦存在一定异质性可能也是一个主要原因。从我们的实验结果分析，CD40在AL患者骨髓单个核细胞表面表达缺如，这导致CD40-CD40L共刺激信号中断，致使T细胞无法识别TCR抗原，CTL就无法对白血病细胞进行识别及杀伤。此外其他共刺激分子如B7、粘附分子如ICAM-1的表达以及IL-12、INF-γ等效应性细胞因子的分泌都会因CD40的表达缺乏而受到影响，从而使机体抗白血病免疫防御能力下降。CD40-CD40L因为与凋亡相关基因如survivine、c-myc、hTERT等有着密切的联系，还可诱导白血病细胞凋亡[13]，CD40-CD40L信号途径的中断势必由此影响白血病细胞的凋亡。

CD40-CD40L配基化作用的下游信号可能参与抗凋亡基因survivinmRNA的转录。现认为肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)是介导CD40分子信号传递的中心分子，其中活化的NF-κB能够有效诱导Survivin基因表达。CD40表达缺陷可能由此影响白血病细胞凋亡程序参与CD40阴性表达AL的发生发展。AML-M 3及CM L存在一定数量的CD40表达，可能还与它具有相对独立的发病机制，使AML细胞逃避更为复杂的免疫监视有关。此外，我们也发现，未治疗的初诊AML患者(除M 3外)，CD40表达缺陷，当化疗达完全缓解及部分缓解后，CD40的表达升高，表明CD40的检测可能作为评估AML(除M 3外)疗效的一项指标。

我们的结果显示健康对照组和各型白血病组骨髓单个核细胞表面CD40L的表达均为阴性，这与师帅帅等[14]的研究结果也存在差异，他们的研究表明部分白血病不仅单独表达CD40，也合并表达CD40L，CD40与 CD40L与高白细胞计数、低血小板数、脾大等临床表现有相关性。存在这样的差异可能与CD40L主要表达在激活的T细胞，且表达具有瞬时性[15]有关。

目前除了骨髓移植及化疗外，肿瘤免疫治疗是白血病治疗的另一主要努力方向。为设计高效的白血病免疫治疗方案，可上调HLA抗原及协同刺激分子在白血病细胞表面的表达，从而提高白血病细胞的抗原递呈能力。我们的初步研究表明CD40表达缺陷与AL白血病细胞的免疫逃逸可能有关，期望能对CD40阴性表达AL的免疫治疗提供实验依据。

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Expression of CD40,CD40L on mononuclear cells surface of myeloid leukemia and it sclinical significance.

FENG Yong-huai,WU Liu-song,FANGNing,FENG Zi-fang,CHEN Qi.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of ZunyiMedical College,Zunyi563003,Guizhou,CHINA

ObjectiveTo study the expression characteristics of costimulatory molecules CD40and CD40L in bonemarrow mononuclear cells in human acute and chronicm yeloid leukem ia before and after the chemotherapy,and to explore their significance in antileukem ia immunity.MethodsThe expression of costimulatory molecules CD40and CD40L in bonemarrow mononuclear cellswasmeasured in 37 patientsw ith acutemyeloid leukem ia(AML group)and 20 patientsw ith chronicmyeloid leukem ia(CML group)before and after chemotherapy by immunofluorescence and FACS. TheResultswere compared w ith eight casesof healthy bonemarrow(the controlgroup).Results①The levelof CD40in AML group except forM 3 before chemotherapy was significantly lower than those in the controlgroup(P＜0.05).②The levelof CD40increased in complete rem ission(CR)and partial rem ission(PR)patientsafter chemotherapy compared w ith that before chemotherapy(P＜0.05).The level in CR patientswas close to that in the control.No significant change was found in nonrem ission(NR)patients(P＞0.05).③The level of CD40in CML patientswas close to that in the control,No significant changewas found in CML patients(P＞0.05).④Moreover,the CD40L are deficient in BMMC of all cases,including AML,CML and healthy volunteers(P＞0.05).ConclusionCD40are important costimulatorymolecules during the pathogenesis and antileukem ia immunity of AML.The level of CD40may be related to differentiated degree and classification ofmyeloid leukema.Their abnormal levelmay partly be responsible for the pathogenesis of AML and be closely related w ith the clinical curative effects.Itmay be one of importantmeans to treathuman acute myeloid leukem ia immunogenetically by regulating theexpression of CD40inmononuclear cellsand by correcting the immunodeficiency of AML patients.

M yeloid leukem ia;M ononuclear cell surface;CD40;CD40L

R733.7

A

1003—6350（2014）04—0523—03

2013-07-11)

贵州省科学技术基金项目(编号：黔科合丁字[2006]2071号)

陈琦。E-mail:zyfychenqi@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0201