胰腺癌细胞BXPC-3转染条件的优化

卜海激，王毛毛

·论著·

胰腺癌细胞BXPC-3转染条件的优化

卜海激，王毛毛

目的 探讨实验室常用的人胰腺癌细胞株BXPC-3的有效转染方法及最佳转染参数。方法 通过脂质体法和电穿孔法将表达绿色荧光蛋白的质粒(pGFP-N3)导入人胰腺癌细胞株BXPC-3中，24 h后观察并比较细胞的存活率及瞬转效率，确定最佳转染参数。结果 常规脂质体法BXPC-3细胞瞬转阳性率为1.36%，细胞存活率为87.45%;而电穿孔法在电压120 V电击时程70μs条件下，BXPC-3细胞瞬转阳性率为54.78%，细胞存活率为64.01%，2种转染方法的瞬转阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 转染BXPC-3细胞，电穿孔法可取得比常规脂质体法更高的转染效率。通过条件的优化，电穿孔法可以用于某些脂质体法难以有效转染的细胞株。

细胞转染;电穿孔法;脂质体法;胰腺癌

近年来，基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。常用的转染方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体法、逆转录病毒介导转染法、电穿孔法等。其中脂质体法因高效、操作简便、适用的细胞多而被广泛应用［1］。电穿孔方法则是利用细胞膜的保守特性，用高于某一阈值的外加瞬间脉冲电场作用于受体细胞，改变细胞膜结构，在细胞膜形成暂时性纳米大小的孔隙，从而将外源基因导入细胞，具有操作简便快捷、可重复性强、转染率高、适用谱广等优越性，尤其对一些较难转染的细胞亦能获得较高的转染率［2］。但由于电穿孔法转染效率受多种因素的影响，针对特定细胞系的最佳转染条件必须进行个别优化，从而限制了电穿孔法的应用。目前关于胰腺癌细胞株的电穿孔法参数设置和技巧罕见报道。本实验中笔者通过脂质体法及电穿孔法转染贴壁培养的人胰腺癌细胞BXPC-3，以绿色荧光蛋白(pGFP-N3)为报告基因，优化转染条件和参数，探讨BXPC-3的有效转染方法和最佳转染参数。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 电穿孔仪器(ECM 830)购自美国BTX公司，电转槽由电穿孔仪器所配套提供;电转杯为一次性2 mm杯，购自Eppendorf公司; Lipofectamine TM2000、G418及DMEM培养基购自美国Invitrogen公司。

1.2 菌株、质粒和细胞株 大肠杆菌DH5a、质粒pGFP-N3、人胰腺癌细胞株BXPC-3、人肾上皮细胞株293T均为本实验室保存。BXPC-3用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的1640培养基培养;293T细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2恒温培养箱内常规培养。细胞生长至70%～80%融合度时用含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，进行传代。质粒pGFP-N3在大肠杆菌DH5a中按常规方法增殖和筛选。转染pGFP-N3质粒后的细胞48 h后用G418筛选抗性克隆。

1.3 脂质体法转染 取细胞培养用6孔板，转染前24 h用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化对数生长期的BXPC-3细胞，以1×106个细胞/孔铺板，转染前1 h更换不含血清的DMEM培养基;取绿色荧光蛋白质粒 PGFP-N 310μg，加不含血清的DMEM补充至250μl，充分混匀，室温孵育10 min;取脂质体10μl加入不含血清的DMEM补充至250μl，充分混匀，室温下孵育5 min;将配置好的含质粒DMEM加入到含脂质体的DMEM中，充分混匀;室温静置20 min，加入无血清培养基至1 m l; 6孔板每孔加转染液1 ml，十字方向混匀，37℃、5%CO2孵箱中培养;以高转染效率的293T细胞同步转染作为阳性对照，以空白载体pcDNA3.1替代PGFP-N3同步转染作为阴性对照。24 h荧光显微镜下观察。

1.4 电穿孔转染 收集对数生长期的BXPC-3细胞，离心沉淀;重悬于PBS中，细胞密度调至2.5× 106～2.5×107个/m l，转移400μl细胞悬液至电转杯中，将之放在冰上。设置电转参数，在正式电穿孔前用含PBS的空电转杯通电2次。细胞悬液中加入10～30μg PEGFP-N3质粒，体积＜40μl，混匀。将电转杯放入电转仪中，电击前后冰浴10 min，电击后将细胞放入培养皿中加完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱中培养，24 h荧光显微镜下观察。

1.5 细胞存活率和转染阳性率观察 转染后台盼兰染色计数细胞存活率。24 h后在倒置荧光显微镜下随机计数5个高倍视野发出绿色荧光的细胞，计数瞬时转染阳性率。

1.6 统计学处理 所有数据均应用SPSS 11.0软件进行统计学处理。每组试验设置3组重复，数据以均数±标准差(±s)表示，组间差异用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质体法转染BXPC-3细胞结果 293T细胞为脂质体法高转染率细胞，采用293T作为实验阳性对照组。结果显示293T脂质体法转染后细胞存活率为93.65%，瞬转阳性率为89.23%(图1A、B);而同步转染的BXPC-3细胞存活率为87.45%，瞬转阳性率仅为1.36%(图1C、D);提示常规脂质体法BXPC-3细胞转染效果欠佳。笔者通过血清饥饿、甘油/二甲亚砜休克法、增加脂质体孵育时间及浓度等方法试图提高转染效率，均未明显提高转染效率(数据未显示)。

2.2 电穿孔法转染BXPC-3细胞结果 电穿孔法显示对BXPC-3细胞有较高的转染效率(图1E、F)。设置电压参数时发现，随着电压由80 V至200 V逐渐增加，BXPC-3细胞存活率逐渐下降;瞬转阳性率则是开始随电压增加而增高，在120 V时达到峰值，而后阳性率又逐渐降低(图2)。电击时程(pulse length)对转染影响显示，随时程延长，细胞存活率略有降低，而转染阳性率则逐步增加，至70μs时获得最高的转染效率(图3)。统计学分析显示，在电压120 V，脉冲时间70μs时转染细胞的存活率为64.01%，满足实验存活细胞的基本要求。而瞬转阳性率为54.78%，与常规脂质体法转染BXPC-3细胞的阳性率差异有统计学意义(t= 25.94，P＜0.05);提示电穿孔法对脂质体法难转的BXPC-3细胞有较好的转染效率。经电穿孔法转染后再通过G418抗性筛选可获得稳定表达pGFP的BXPC-3细胞株。

图1 光镜及荧光倒置显微镜下观察细胞转染效率

图2 电压对细胞存活率和转染阳性率的影响

图3 电击时程对细胞存活率和转染阳性率的影响

3 讨论

近年来各种脂质体法快速发展，广泛应用于多种细胞的基因转染。然而有些悬浮细胞［3］及本实验中的BXPC-3细胞等，使用常规脂质体法转染效率低;某些细胞如血细胞及肝细胞等［4］对脂质体法的细胞毒性敏感，转染后细胞存活率低。此时与常规脂质体相比，电穿孔法具有重复性强、安全性高等优点，通过调整电转参数的设置能获得良好的转染效果［5-7］。

本实验用脂质体法和电穿孔法2种方法将pGFP-N3绿色荧光蛋白转染人胰腺癌细胞株BXPC-3，检测瞬时转染效率，发现常规脂质体法和电穿孔法转染效率有明显差异，电穿孔法对脂质体法难转的BXPC-3细胞有较好的转染效率。

影响电穿孔转染率和细胞存活率的因素很多，如电击电压、电击时程、电击次数、温度、缓冲液成分、细胞状态和体积、质粒的浓度和构象等，因此特定细胞系的最佳转染条件必须进行个别优化［8-9］。

转染细胞的状态是影响转染率的重要原因。处于对数生长期的细胞增殖速度快，细胞表面结构致密度比稳定期的细胞差，电穿孔后受体细胞膜的恢复能力较强，其转染率和存活率都比生长过老的细胞高。Takahashi等［10］通过增加S期细胞的比例提高了电穿孔转染率，提示细胞状态和细胞周期能对电穿孔效率起很重要的作用。沈慧玲等［11］亦证实，对数生长期的白血病细胞转染率是生长过老细胞的近10倍，而存活率较后者高r倍左右，表明取对数生长期的细胞进行电穿孔转染可明显提高转染率。

转染缓冲液成分对转染率也有一定的影响。血清被认为是影响转染效率的重要因素。在多种脂质体中，血清的存在可降低脂质体的细胞毒性作用，使细胞转染的存活率升高。但同时血清可干扰脂质体与DNA形成复合物的能力从而降低细胞转染率。因此目前脂质体法转染中较为广泛应用的是不含血清的磷酸缓冲液或低渗转移缓冲液。血清成分的缺乏是导致脂质体法细胞毒性作用大的一个重要因素，从而限制了脂质体法在部分细胞的应用。而电穿孔转染法中，常用的电转液为低渗及高导电性的转移缓冲液，如PBS及标准培养基。Miyahara等［12］实验证明，使用0.77 mol/L的甘露醇溶液可以完全替代 IMK成分培养基，两者的转染效率无明显差异。

电击电压和电击时程参数的设置是电穿孔实验成败的关键［13］。在本实验中，笔者针对人胰腺癌细胞株BXPC-3电穿孔电压和时程参数进行了摸索，首先设定了电压参数。电压太低时，电击穿孔条件不充分，则转染率不高;如果电压过高，则细胞损伤重，电转后存活率低，同样影响转染率。电压参数可根据电转细胞的直径作粗略的估计，细胞越大所需的电压越小。笔者通过在电转液中悬浮细胞10～20 min后测量细胞直径获得电转电压的粗略值。然后在80～200 V之间调整电压，在120 V时获得较高的转染率以及较满意的细胞存活率。电击时程和电压一起维持电击孔隙的形成，可根据波形为方形波或者呈指数衰减型波设置参数。常规在10～200μs之间。电击时程为10～70μs时，随电击时程增加，电击瞬转效率逐步增加。70μs时瞬转率最高，而后瞬转阳性率又逐步下降。因此笔者认为，电压120 V、电击时程70μs时为最佳的电转参数，此时电转的瞬转阳性率为54.78%，细胞存活率为64.01%，明显优于常规脂质体法的阳性率1.36%。

本实验成功电转胰腺癌细胞株BXPC-3细胞，为实验中利用BXPC-3细胞进行各种基因研究提供了实验基础，也为实验室其他细胞电击参数的设置和技巧提供了参考。

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Optim ization of transfection conditions for human pancreatic cancer cell line BXPC-3

BU Hai-ji，WANGMao-mao

(Department of Pathology，No.455 Hospital of CPLA，Shanghai200052，China)

Objective To investigate transfectionmethods and conditions for human pancreatic cancer cell line BXPC-3 and related optimal transfection data.Methods The plasm pGFP-N3 was transfected into BXPC-3 cells respectively by lipofectamine 2000 and electroporation.Then，survival and transient transfection rates of the cells were observed and compared after 24 hours，so as to identify the optimal transfection data.Results The positive BXPC-3 transient transfection efficiency by lipofectamine 2 000 was 1.36%，with the cell survival rate of 87.45%，while the transient transfection efficiency by electroporation with the pulse length of70 μs and electric shock of 120 V was 54.78%，with the cell survival rate of 64.01%.Statistics indicated that there were significant differences in the transient transfection rates，when comparisons weremade between the 2 transient transfection methods(P＜0.05).Conclusion In the transfection of BXPC-3，electroporation could achieve higher transfection rates than the conventional lipofectamine.Through optimization of transfection conditions，electroporation could effectively transfect certain cell strains，which were hard to be transfected by lipofectamine.

Cell transfection;Lipofectamine;Electroporation;Pancreatic cancer

R735.9

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.002

2014－01－20)

(本文编辑:林永丽)

200052 上海，解放军第四五五医院(卜海激);解放军第四一一医院(王毛毛)

王毛毛，电子信箱:mm1b@sina.com