血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠血管新生的影响

崔 炯，邓金秀，万建新

·论著·

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠血管新生的影响

崔 炯，邓金秀，万建新

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)对慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)大鼠肾小球内皮细胞修复和血管新生的影响。方法 体外分离、培养大鼠MSCs，Ad5-hVEGF-EGFP转染MSCs并观察转染对细胞增殖，分泌VEGF的影响。50只雄性SD大鼠按数字表法随机分为假手术组、慢性肾衰竭组、MSCs移植组、Ad-VEGF注射组和VEGF基因转染的MSCs移植组，每组10只。采用分阶段5/6肾切除术制备大鼠慢性肾衰竭动物模型。假手术组与慢性肾衰竭组于切除右肾之前从该侧肾动脉注射不含血清的改良杜氏伊格尔(DMEM)培养液，其余3组分别给予MSCs，Ad-VEGF和VEGF基因转染的MSCs。8周后检测各组大鼠肾功能，并用免疫组化检测肾小球CD31表达情况。结果 Ad5-hVEGF-EGFP转染后对MSCs细胞增殖无影响，转染后分泌VEGF蛋白较空质粒转染组明显增加(P＜0.05)。MSCs移植组和VEGF基因转染的MSCs移植组血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)均较慢性肾衰竭组降低(P＜0.05);与MSCs移植组比较，VEGF基因转染的MSCs移植组Scr和BUN降低更显著(P＜0.05)。慢性肾衰竭组肾小球中CD31表达较假手术组显著降低(P＜0.05)，应用MSCs和VEGF165基因转染的MSCs干预后肾小球中CD31表达有所增加，VEGF基因转染的MSCs组增加更明显(P＜0.05)。结论 慢性肾衰竭大鼠给予转染VEGF基因的MSCs移植后毛细血管内皮细胞数量增多，肾脏功能改善;其作用可能与基因转染增加VEGF表达及有利于肾小球毛细血管内皮修复、血管新生有关。

血管内皮细胞生长因子;骨髓间充质干细胞;慢性肾衰竭;大鼠;血管新生

肾小球毛细血管网的毁损及后续的血管新生修复反应不全，是慢性进展性肾脏病的显著特征，并将导致肾小球硬化的发生［1］。国外研究表明，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能促进肾脏血管新生和内皮细胞修复［2］。Okuyama等［3］的研究认为MSCs在转化为血管内皮样细胞的过程中局部血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激起了重要作用。由于VEGF生物半衰期短，注入体内易稀释，故外源给予VEGF蛋白诱导分化效力有限，而基因治疗有望克服此缺陷。MSCs可接受多种载体的基因转染并在体内分化后保持良好的遗传稳定性，细胞治疗结合基因治疗已证实对多种动物模型有效促进血管再生作用，但对慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)大鼠的影响尚未有研究报道。本研究在体外构建重组VEGF腺病毒质粒转染MSCs并经肾动脉移植，探讨对慢性肾衰竭大鼠肾功能和肾小球内皮细胞修复和血管新生的影响，旨在为慢性肾衰竭的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

3周龄雄性清洁级SD大鼠50只，用于MSC的分离及培养(由吴氏实验动物中心提供)，体质量50～100 g。8周龄雄性清洁级SD大鼠50只(由吴氏实验动物中心提供)，体质量150～200 g，按数字表法随机分为5组，每组10只，分别为:假手术组(组Ⅰ)、慢性肾衰竭组(组Ⅱ)、MSCs移植组(组Ⅲ)、Ad-VEGF注射组(组Ⅳ)和VEGF基因转染的MSCs移植组(组Ⅴ)。

1.2 药品与试剂

Ad5-hVEGF-EGFP(北京本元正阳基因技术有限公司)、胎牛血清(Gibco，USA)、DMEM/F12培养液(Gibco，USA)、CD 31单克隆抗体(Abcam，英国)、抗大鼠VEGF(Abcam，英国)、大鼠VEGF ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。

1.3 方法

1.3.1 MSC的分离、培养与VEGF基因转染 3周龄雄性SD大鼠(由吴氏实验动物中心提供)，体质量50～100 g。颈椎脱臼法处死大鼠，获得其长骨骨髓液，1 500×g离心5min，弃上清，用15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞。转移至25 cm2的培养瓶中培养，放37℃、5%CO2，饱和湿度的培养箱中孵育，长至80%～90%融合时用0.125%胰酶消化l:3传代细胞。取生长状态良好的3代MSCs，融合至60%，用无血清DMEM/F12培养基饥饿12 h后换成15%胎牛血清的DMEM/F12，同时按照细胞与Ad-hVEGF-EGFP质粒=1∶100进行共培养，24、48和72 h荧光显微镜下观察转染率。

1.3.2 噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖 取对数生长期的MSCs按每孔104个细胞/ml接种于96孔板，用15%胎牛血清的DMEM/F12培养液37℃，5%CO2孵育，细胞长至60%～70%融合后，按照前述方法对细胞进行转染，浓度设6个复孔。转染成功后每个孔加入10μl新鲜配制的MTT溶液(5 mg/ ml)，孵育4 h。吸去培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，振荡5 min后，490 nm处读取光密度(OD)值。实验重复3次，取平均值。同时设置空质粒转染组作为对照。

1.3.3 细胞上清的收集及外分泌VEGF的ELISA法检测 转染后第4、7、10、14天收集上清并保存于－70℃待检，酶标仪测各组VEGF蛋白浓度。

1.3.4 动物模型制备及分组干预 采用分阶段5/6肾切除制备大鼠慢性肾衰竭模型:10%水合氯醛腹腔麻醉后，经侧腹部切口，暴露左侧肾脏，分离肾动脉及其分支，结扎其中的左上支和中支并剪断，使左肾梗死约2/3，3 d后再将大鼠右肾摘除。假手术组仅分离肾动脉及其分支，不予结扎，3 d后同期手术，但仅剥离右肾包膜暴露肾脏后关腹。长至90%的Ad-VEGF-GFP的 MSCs用0.125%胰酶消化，并对其进行细胞计数，用无血清的DMEM/F12重悬细胞至1×106个/m l。VEGF基因转染的MSCs移植组注入1×106个MSCs/Ad-VEGF，MSCs移植组注入1×106个MSCs，Ad-VEGF组注入VEGF基因质粒，假手术组与慢性肾衰竭组注入不含血清的DMEM培养液。均于切除右肾之前从该侧肾动脉注射，注射量1 ml。所有大鼠均于造模后8周处死。

1.3.5 大鼠肾功能检测 处死大鼠时经心脏取血2 ml，用全自动生化分析仪测定血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)。

1.3.6 免疫组织化学及半定量检测CD31表达2μm的石蜡切片，常规二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，滴加3%H2O2去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，加入适当比例稀释的一抗50μl，37℃孵育1 h，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色。镜下观察染色情况，蒸馏水及时终止反应，自来水冲洗5 min;苏木素淡染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用PBS代替一抗作为阴性对照。阳性反应物部位呈棕色，细胞核呈淡蓝色。在400倍的显微镜视野下，每张切片于皮髓质交界处随机取5个不重复视野的肾小球，由摄像系统提取数据化病理图象，输入图像分析系统Motic Images Advanced进行光密度(OD)值计算，取平均OD值进行统计分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组间比较经方差齐性检验再进行方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

8周显示造模成功，表现为慢性肾衰竭组BUN、Scr较假手术组明显升高，病理示肾小球毛细血管塌陷，肾小管上皮细胞空泡变性、肿胀及脱落。成功率100%。

2.1 MSCs形态特征

大鼠MSCs在24 h就可以见到细胞贴壁，随着时间的推移细胞呈梭形，三角形，最后成片状，4 d后可以铺满瓶底，传代之后细胞呈长梭形或者纤维状，细胞折光性增强。

2.2 VEGF基因转染

将携带绿荧光蛋白的Ad5-hVEGF-EGFP按细胞:Ad5-hVEGF-EGFP为 1∶100转染 3～5代的MSCs。转染24 h后在荧光显微镜下观察，见少量MSCs出现绿色荧光;转染3d后MSCs基本全部表达绿荧光蛋白，显示转染效率较高。见图1。

图1 VEGF基因转染MSCs(DAB染色 ×100)

2.3 转染对MSCs活性的影响

转染对细胞增殖没有明显影响，见图2。

图2 MTT法检测转染对细胞活性的影响

2.4 细胞上清VEGF的表达

VEGF基因转染组表达明显高于空质粒转染组，差异有统计学意义(P＜0.05)，随培养时间的延长量渐升高，4～7 d至高峰，后逐渐降低。见图3。

图3 转染后上清中VEGF的累积浓度

2.5 各组肾功能的变化

于5/6肾大部切除术后8周检测各组大鼠肾功能，结果显示慢性肾衰竭组Scr和BUN均较假手术组增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与慢性肾衰竭组比较，注射MSCs和VEGF基因转染的MSCs干预后Scr和BUN均较慢性肾衰竭组降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，单纯Ad-VEGF干预组未显示降低，差异无统计学意义。与MSCs组比较，VEGF基因转染的MSCs移植组Scr和BUN降低更显著，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响(±s)

表1 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响(±s)

注:与假手术组比较aP＜0.05;与慢性肾衰组比较bP＜0.05;与MSCs移植组比较cP＜0.05。VEGF为血管内皮生长因子，MSCs为骨髓间充质干细胞

组别 鼠数 肌酐(μmol/L) 尿素(mmol/L) 10 15.65±0.41 5.37±0.78慢性肾衰竭组 10 110.23±23.35a18.24±2.14aMSCs移植组 10 78.56±16.22ab14.77±2.06abAd-VEGF注射组 10 107.17±18.57a18.54±3.57aVEGF基因转染的MSCs移植组 10 64.37±9.56abc11.43±2.95假手术组abc

2.6 各组肾小球CD31表达

慢性肾衰竭组肾小球中CD31表达较假手术组显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，应用MSCs和VEGF基因转染的MSCs干预后肾小球中CD31表达有所增加，VEGF基因转染的MSCs组增加更为明显(P＜0.05)。而单纯Ad-VEGF干预组未显示出明显增加(图4)。半定量分析计算的IOD值(图5)。

3 讨论

肾脏内皮功能紊乱、内皮细胞凋亡增加、微血管网减少与肾小球硬化及间质纤维化直接相关。在残余肾模型中，肾小球毛细血管数目随内皮细胞凋亡而进行性减少［4］。MSCs是一种具有多项分化潜能的多能干细胞，不仅能分化成内皮细胞，形成新生血管，而且还可上调促血管生长因子的表达，分泌多种细胞因子，如VEGF等［5］，促进MSCs迁移、分化和血管新生［6］。VEGF是存在于血管内皮细胞的特异性促血管生长因子，对血管内皮细胞有强烈的促分裂、趋化、再生和修复的作用。转染VEGF基因的MSCs能分化为形成血管的细胞［7］。以VEGF和MSCs为基础的基因－细胞联合治疗，有望为血管再生和损伤肾脏组织修复提供应用前景。

本研究采用携带VEGF基因的重组腺病毒转染MSCs，倒置相差共聚焦荧光显微镜下观察发现其转染率较高。ELISA法检测外发现分泌VEGF蛋白的表达较空质粒转染组明显升高，并且细胞生长未受到影响，提示VEGF转染有效且转染后不影响MSCs的增殖并分泌VEGF，转染的腺病毒并不影响细胞的活性。MSCs具备较强的增殖能力，易于转染外源性基因且有较高的转染率，可作为基因治疗的靶细胞。

图4 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞对CRF大鼠肾组织CD31表达的影响(免疫组织化学染色 ×400)

图5 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞对各组大鼠肾组织CD31表达的影响

CD31是表达于血管内皮细胞表面的抗原，是检测血管内皮细胞的常用标志物。本研究发现慢性肾衰竭组肾小球中CD31表达明显降低，应用MSCs和VEGF基因转染的MSCs干预后表达增加，VEGF基因转染的MSCs组增加更为明显。研究证实残肾内皮细胞减少，毛细血管毁损，MSCs移植促进肾脏内皮细胞修复;而VEGF基因转染的MSCs移植修复肾小球毛细血管内皮细胞数量及增加毛细血管密度效果更为显著。VEGF直接特异地促进血管内皮细胞的增殖和迁移，促进侧支血管的形成［8］;有研究表明剔除VEGF基因片段的MSCs的肾脏保护作用明显下降［9］。因此，笔者推测VEGF转染MSCs后仍可以保持其干细胞的多向分化潜能;同时表达VEGF增加，通过自分泌和旁分泌功能，创造了有利于MSCs向血管内皮样细胞分化的微环境，这种正反馈作用促进了血管内皮细胞增殖分化和血管新生。

Yuan等［10］将VEGF基因转染至人胚胎间充质干细胞，再通过尾静脉输入顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型后发现，VEGF-MSCs对肾脏的保护作用优于单纯的MSCs，肾脏功能和结构的损伤明显改善。笔者研究发现 MSCs移植组、VEGF基因转染的MSCs移植组肾功能均较慢性肾衰竭组、单纯Ad-VEGF干预组改善;VEGF基因转染的MSCs移植组改善更明显。而单纯基因干预组肾功能及肾血管内皮细胞减少均无明显改善，分析原因残肾组织存活细胞数量减少，单纯基因转染缺乏有效的反应靶细胞。而携带VEGF基因的重组腺病毒转染MSCs的基因－细胞联合治疗既提供了外源性细胞补充，又能高效表达VEGF，对促进肾小球毛细血管内皮细胞新生和损伤肾脏修复较单纯干细胞显示出更大的优越性。

综上所述，Ad-VEGF能有效转染MSCs，慢性肾衰竭大鼠给予转染VEGF基因的MSCs移植后肾小球毛细血管内皮细胞数量增多，肾脏功能改善;较单纯MSCs移植疗效更为显著。其作用可能与基因转染增加VEGF表达，有利于肾小球毛细血管内皮修复、血管新生有关。以VEGF和MSCs为基础的基因－细胞联合介入治疗，为血管再生和损伤肾脏组织修复和血管再生方面显示了良好的应用前景。基因转染的MSCs在体内是否还可以通过转分化机制修复慢性肾衰竭大鼠肾脏损害，还需要荧光组化等方法观察MSCs向血管内皮细胞的分化情况。

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Effects of bone marrow mesenchymal stem cell gene transfection by VEGF gene on angiogenesis in rats with chronic renal failure

CUIJiong，DENG Jin-xiu，WAN Jian-xin

(First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China)

Objective To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cell(MSCs)gene transfection by VEGF (vascular endothelial growth factor)gene on the repair of glomerular endothelia and angiogenesis in ratswith chronic renal failure(CRF).Methods MSCs isolated from rat bone marrow were cultured and transfected with recombinant Ad5-hVEGF-EGFP.Then，effects of transfection on cell proliferation and secretion of VEGF were observed closely.Fiftymale SD ratswere randomly divided into5 groups:the sham operation group，the CRF group，the MSCs transplantation group，the Ad-VEGF injection group and the MSCs transfected by VEGF gene group.The animal CRFmodelwas established by a two-stage5/6 nephrectomy procedure in rats.For the animals of the sham operation group and the CRF group，DMEM culture solution without serum was injected through the right renal artery prior to nephrectomy of the right kidney.The animals of the other3 groupswere treated with MSCs，Ad-VEGF and MSCs transfected by VEGF genes.After8 weeks，the renal function ofall the groupswas detected and CD31 expression in glomeruluswasmeasured by immunohistochemistry.Results The effect of Ad5-hVEGF-EGFP on the proliferation ofMSCs could notbe detected after transfection.The level of VEGF protein in supernatantafter VEGF gene transfection was significantly higher than that of the control group(P＜0.05).The Scr and BUN levels in the MSCs transplantation group and the MSCs transfected by VEGF gene group were lower than those of the CRF group(P＜0.05).As compared with those of the MSCs transplantation group，the levels of Scr and BUN for the MSCs transfected by VEGF gene group were even lower (P＜0.05).CD31 expression in glomerulus for the CRF group was decreased，as compared with thatof the sham operation group(P＜0.05).However，CD31 expression in glomerulus was increased to some extent following treatment by MSCs or MSCs transfected by VEGF gene(P＜0.05).CD31 expression level was increased more significantly for the MSCs transfected by VEGF gene group(P＜0.05).Conclusion The number of capillary endothelia was increased and renal function improved，following transplantation ofMSCs transfected by VEGF gene in ratswith chronic renal failure，whichmightbe associated with the increased expression of VEGF gene after gene transfection，its beneficial effect on the repair of glomerular capillary endothelia and angiogenesis aswell.

Vascular endothelial growth factor;Mesenchymal stem cells;Chronic renal failure;Rat;Angiogenesis

R692.5

A

10.3969/j.issn.1009－0754.2014.06.001

2014－08－07)

(本文编辑:莫琳芳)

福建省自然科学基金资助项目(2012J01343)

350005 福州，福建医科大学附属第一医院肾内科

万建新，电子信箱:wanjx@263.net