他克莫司对黑素细胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表达的影响

李文彬，董 妍，闫小宁，李美红，刘燕婷，赵一丁

(1.陕西省中医医院皮肤科，陕西西安 710003；2.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西西安 710004)

他克莫司对黑素细胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表达的影响

李文彬1，董 妍2，闫小宁1，李美红1，刘燕婷1，赵一丁1

(1.陕西省中医医院皮肤科，陕西西安 710003；2.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西西安 710004)

目的评价他克莫司对人表皮黑素细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及基质金属蛋白酶-2，9(MMP-2、MMP-9)表达的影响。方法实验分为正常对照组和他克莫司(10、102、103、104nmol/L)处理组，采用Q-RT-PCR和Western blotting方法检测不同浓度他克莫司对10 ng/m L肿瘤坏死因子-α(TNF-α)预处理后黑素细胞ICAM-1表达的影响，及他克莫司对黑素细胞MMP-2、MMP-9表达的影响。结果与对照组相比，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)可抑制TNF-α诱导的黑素细胞ICAM-1的表达(P＜0.05，P＜0.01)；他克莫司(10、102、103、104nmol/L)可以促进黑素细胞MMP-2、MMP-9的表达(P＜0.05，P＜0.01)。结论他克莫司可能通过抑制ICAM-1表达及促进MMP-2、MMP-9的表达，减少免疫损伤及促进黑素细胞迁移，这可能是其临床有效治疗白癜风的机制之一。

他克莫司；细胞间粘附分子-1；基质金属蛋白酶；黑素细胞

白癜风是一种由于黑素细胞损伤导致皮肤及毛囊黑色素脱失的获得性皮肤病。自身免疫异常是白癜风发病机制之一，其中T淋巴细胞介导黑素细胞损伤在发病中发挥着重要作用［1］。因此，阻止黑素细胞与淋巴细胞粘附与促进皮损周围正常黑素细胞向皮损部位迁移是白癜风治疗的关键环节。细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)与白癜风的疾病进展密切相关，可促进T淋巴细胞与黑素细胞粘附，从而导致黑素细胞的破坏［2］。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一类依赖钙锌等离子的内肽酶，其活性与细胞的迁移能力密切相关［3］。

他克莫司是一种新型免疫调节剂，可通过抑制T细胞活化发挥免疫调节作用［4］。他克莫司软膏可有效促进白癜风皮损复色，但机制尚不清楚。本课题组前期研究发现，他克莫司可促进黑素细胞黑素合成和酪氨酸酶活性［5］。在此基础上本研究将继续观察他克莫司对黑素细胞ICAM-1、MMP-2、MMP-9表达的影响，进一步探讨他克莫司对黑素细胞的生物学活性的调节作用，为临床治疗白癜风提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料人表皮黑素细胞由第四军医大学口腔医院馈赠；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物科技有限公司；他克莫司、TNF-α、胰蛋白酶溶液购自美国Sigma公司；黑素细胞M254基础培养基、黑素细胞生长添加物HMG、DMEM培养基购自Gibco公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒购自Ta KaRa公司；鼠抗ICAM-1单克隆抗体购自美国Proteintech公司；鼠抗MMP-2、鼠抗MMP-9单抗购自Santa Cruze公司；兔抗β-actin多克隆抗体、HRP标记羊抗鼠IgG、ECL化学发光显色剂购自美国Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 黑素细胞的培养和传代 将培养瓶中的黑素细胞用2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化后，反复吹打成单细胞悬液，离心去上清，加入含50 m L/L的FBS，100 U/m L青霉素和100μg链霉素，b FGF的M254培养基的黑素细胞培养液中接种于培养瓶中，在37℃、50 m L/L CO2培养箱中培养，待细胞铺满培养瓶后进行传代培养。

1.2.2 实验分组 将黑素细胞以密度为5×104接种于96孔培养板，24 h后待细胞生长至80%融合时，吸弃培养液，PBS洗2遍后加入少量PBS液；他克莫司组：添加含不同浓度他克莫司(10、102、103、104nmol/L)的培养液。对照组：添加黑素细胞培养液；每组设4个复孔。

1.2.3 实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR）检测 采用Trizol法提取细胞总RNA，根据试剂盒说明提取细胞cDNA。PCR反应引物序列：ICAM-1：5'-GCAGACCACTGTGCTTTGAG-3'，5'-GCAGACCACTGTGCTTTGAG-3'；MMP-2：5'-CACTTTCCTGGGCAACAAAT-3'，5'-TGATGTCATCCTGGGACAGA-3'；MMP-9：5'-TTCAAGGCTGGGAAGTACTG-3'，5'-TCCGGAGGGCCCCGGTCACCT-3'；βactin：5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'；5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'。引物序列由上海生工合成。按照SYBR®Premix Realtime PCR Mix试剂说明使用BioRad iQ5 and MyiQTMReal Time PCR Detection System完成Real time PCR反应；每一样本同时进行3个PCR反应检测，用内参βactin对ICAM-1、MMP-2、MMP-9的m RNA表达水平做标准化处理；用Bio Rad iQ5 PCR仪所带统计软件进行数据处理(统计方法为△△Ct法，基因的相对表达按2-△△Ct)，以比较标准化后各组ICAM-1、MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达水平。反应体系采用两步法在BioRad iQ5 and MyiQTMReal Time PCR Detection System完成Real time PCR反应。反应条件：预变性95℃3 min，PCR反应40个循环，95℃10 s，55℃30 s。

1.2.4 Western blotting检测 取20μg蛋白样品，用120 g/L SDS-PAGE进行电泳，然后在电转移装置上，100 V恒压转移1 h。将PVDF膜置于含50 g/L脱脂牛奶的TBS-T溶液中4℃封闭过夜；ICAM-1、MMP-2、MMP-9和β-actin一抗分别用TBS-T按1∶2 000和1∶1 000稀释，膜置于一抗稀释液中室温缓慢摇动1 h，二抗辣根过氧化物酶标记的IgG多克隆抗体用TBS-T按1∶200稀释，膜在二抗稀释液中室温慢摇1 h。暗室内ECL发光检测。每个实验组设有4个复孔，每个样本重复检测3次。

1.3 统计学分析数据用均数±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行分析。对正态分布且方差齐的资料采取单因素方差分析检验，若统计量F值有统计学意义时，各组间均数两两比较采取LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 他克莫司对黑素细胞ICAM-1 mRNA表达的影响为了观察他克莫司对TNF-α诱导黑素细胞ICAM-1表达的作用，本研究根据文献［6］选用10 ng/mL TNF-α预处理实验各组黑素细胞诱导其ICAM-1呈过表达，孵育72 h后采用Q-RT-PCR检测。结果显示，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同浓度组与对照组相比，黑素细胞ICAM-1 mRNA的相对表达量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01，表1)。

2.2 他克莫司对黑素细胞ICAM-1蛋白表达的影响采用浓度为10 ng/m L TNF-α作用于实验各组黑素细胞，孵育72 h后采用Western blotting检测。实验各组条带与内参β-actin蛋白条带吸光度校正分析后表明，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)各组与对照组相比，黑素细胞ICAM-1蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01，图1)。

表1 不同浓度他克莫司对黑素细胞ICAM-1 mRNA表达的影响Tab.1 Effects of different concentration of tacrolimus on the expression of ICAM-1 mRNA in melanocytes(2-△△Ct)

图1 Western blotting检测各组细胞ICAM-1蛋白的表达Fig.1 Detection of ICAM-1 protein expression using Western blotting

2.3 他克莫司对黑素细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响实验各组细胞孵育72 h后行Q-RTPCR检测，结果表明，他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同浓度组黑素细胞MMP-2、MMP-9 m RNA的相对表达量与对照组比较明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01，表2)。

表2 他克莫司对黑素细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响Tab.2 Effects of different concentration of tacrolimus on the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in melanocytes (2-△△Ct)()

表2 他克莫司对黑素细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响Tab.2 Effects of different concentration of tacrolimus on the expressions of MMP-2 and MMP-9 mRNA in melanocytes (2-△△Ct)()

与对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别n MMP-2 mRNA MMP-9 mRNA 104nmol/L他克莫司4 2.88±0.12**4.73±1.06**103nmol/L他克莫司4 2.29±0.05**4.29±1.21**102nmol/L他克莫司4 1.95±0.06*3.15±0.63**10 nmol/L他克莫司4 1.41±0.05*2.54±0.13*对照组4 0.23±0.03 1.03±0.07

2.4 他克莫司对黑素细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响实验各组细胞孵育72 h后Western blotting检测结果显示，实验各组条带与内参β-actin蛋白条带吸光度校正分析后表明，他克莫司10 nmol/L组细胞MMP-2蛋白的表达和对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05，图2)；他克莫司(102、103、104nmol/L)不同浓度组与对照组相比，黑素细胞MMP-2蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01，图2)；他克莫司(10、102、103、104nmol/L)不同浓度组与对照组相比，黑素细胞MMP-9蛋白的表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01，图2)。

图2 Western blotting检测各组细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达Fig.2 Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expressions using Western blotting

3 讨 论

白癜风的发病机制仍不明确，其发病可能与机体的细胞免疫和体液免疫密切相关［7-8］。细胞间粘附分子-1(ICAM-1)现统一命名为CD54，是一种重要的免疫球蛋白样的粘附分子，具有多种生物学功能，参与许多自身免疫性疾病的发生。研究表明，ICAM-1介导的细胞毒作用是白癜风患者黑素细胞破坏的重要途径之一，其过程包括通过成对的黏附分子作用与效应淋巴细胞结合，靶抗原与其他细胞表面标志共同活化白细胞表面受体及触发细胞毒性作用等［9］。同时发现白癜风皮损及血清中ICAM-1的水平对白癜风的发病过程及判断疾病的活动性具有一定的指导意义［10］。ICAM-1在正常黑素细胞中表达水平较低，但在某些致炎因子诱导下(如TNF-α、白介素-1、脂多糖、干扰素-γ)黑素细胞ICAM-1可呈高表达，并与其在T细胞表面的配体LFA-1相结合从而促进T细胞活化与粘附。TNF-α是一种重要的前炎症性细胞因子，与许多炎症性疾病、自身免疫疾病及肿瘤发展密切相关，可能在白癜风的发病机制中发挥着一定作用。研究发现，TNF-α可以抑制黑素细胞的增殖和黑素合成，同时TNF-α在白癜风患者的血清中及皮损中的表达均呈过表达，并与ICAM-1表达相一致［11］。

他克莫司作为一种免疫抑制剂，其治疗白癜风机制可能是通过阻断钙调磷酸酶抑制T淋巴细胞的活化及细胞因子的产生，减少局部黑素细胞受损。为了探求他克莫司免疫抑制作用是否与ICAM-1相关，本研究在体外模仿白癜风体内病理环境，选用10 ng/mL的TNF-α作用于黑素细胞，诱导其ICAM-1表达，然后观察他克莫司对黑素细胞ICAM-1表达的影响。结果表明，他克莫司从ICAM-1基因mRNA及蛋白的表达水平上均可抑制TNF-α诱导的黑素细胞ICAM-1的表达，提示他克莫司可能通过抑制ICAM-1表达，从而减弱淋巴细胞对黑素细胞的毒性作用。

白癜风皮损处黑素细胞消失，其复色须经过毛囊黑素细胞储库中前体黑素细胞活化、增殖及向皮损处迁移。其中黑素细胞迁移经过与胞外基质粘附、增殖、基质降解、迁移的过程。MMP是一类锌、钙离子指依赖性内肽酶，其活性成分可降解许多细胞外基质成分，如胶原、明胶、纤维蛋白，从而促进细胞迁移，其中MMP-2、MMP-9的主要作用是降解基底膜Ⅳ型胶原和纤维粘蛋白和层粘连蛋白。研究表明，MMP-2、MMP-9可降解Ⅳ型胶原蛋白并与恶性黑素瘤细胞的生长、侵袭和转移等生物学特性密切相关［12］。目前关于MMP与白癜风黑素细胞的迁移功能的研究较少。LAN等［13-14］认为，他克莫司可能通过间接诱导角质形成细胞分泌MMP的活性增加从而形成有利于黑素细胞迁移的环境；或者通过诱导黑素母细胞向黑素细胞分化促进白癜风复色。近来，LEE等［15］采用明胶酶谱法发现他克莫司直接通过增加MMP-2、MMP-9的活性促进黑素细胞的迁移。本研究采用Q-RT-PCR及Western blotting方法进一步证实他克莫司可能从mRNA及蛋白的表达水平上诱导黑素细胞MMP-2、MMP-9的表达，提示他克莫司可能通过促进白癜风黑素细胞储库中前体黑素细胞向皮损区迁移从而使白癜风皮肤复色。

综上所述，本研究发现他可莫司可以抑制炎症因子TNF-α诱导的黑素细胞ICAM-1表达，同时通过促进MMP-2、MMP-9基因的转录与蛋白表达。因此，我们推测他克莫司可能通过抑制ICAM-1介导的黑素细胞免疫损伤及增强黑素细胞的迁移能力来治疗白癜风，但其具体作用机制仍需进一步研究。

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(编辑 卓选鹏)

The effects of tacrolimus on ICAM-1，MMP-2 and MMP-9 expressions in human melanocytes

LI Wen-bin1，DONG Yan2，YAN Xiao-ning1，LI Mei-hong1，LIU Yan-ting1，ZHAO Yi-ding1
(1.Department of Dermatology，Shaanxi TCM Hospital，Xi'an 710003；2.the Second Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of tacrolimus on intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)，MMP-2 and MMP-9 expressions in human melanocytes.MethodsIn the experiment melanocytes were divide into normal control group and tacrolimus groups(10，102，103and 104nmol/L).Q-RT-PCR and Western blotting were performed to evaluate the effects of tacrolimus on ICAM-1 expression induced by TNF-α(10 ng/m L)and on MMP-2 and MMP-9 expressions in melanocytes.ResultsCompared with that in control group，the expression of ICAM-1 was suppressed markedly in all the tacrolimus groups(P＜0.05，P＜0.01).However，the expressions of MMP-2 and MMP-9 were increased in all the tacrolimus groups(P＜0.05，P＜0.01).ConclusionTopical tacrolimus can be used as an effective agent to treat vitiligo，maybe due to its inhibiting ICAM-1 expression and inducing MMP-2 and MMP-9 expressions，which can reduce immunologic injury and facilitate migration of menalocytes.

tacrolimus；intercellular adhesion molecule-1；matrix metalloproteinase；melanocyte

R751

A

1671-8259(2014)05-0682-04

10.7652/jdyxb201405023

2014-01-02

2014-04-13

陕西省自然科学基金项目(No.2013JM4043) Supported by the Natural Science Foundation of Shaanxi Province(No.2013JM4043)

李文彬(1973-)，男(汉族)，博士，主治医师.研究方向：白癜风、银屑病发病机制的研究.E-mail：boerge@sina.com

时间：2014-07-22 16∶33 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1633.012.html