神经内分泌分化与前列腺癌进展及预后的关系

侯惠莲，张冠军，王鸿雁，宫惠琳，杨 喆，张学斌

(西安交通大学医学院第一附属医院病理科，陕西西安 710061)

神经内分泌分化与前列腺癌进展及预后的关系

侯惠莲，张冠军，王鸿雁，宫惠琳，杨 喆，张学斌

(西安交通大学医学院第一附属医院病理科，陕西西安 710061)

目的研究神经内分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)与前列腺癌(prostate cancer，PCa)发展及预后的关系。方法收集有随访资料的61例PCa穿刺活检标本，采用免疫组化法检测嗜铬素A(chromogranin，Cg A)、神经特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、突触素(synaptophysin，Syn)在选定标本中的表达，分析NED与PCa各临床病理参数及患者生存时间的关系，多因素Cox风险模型分析影响PCa患者预后的危险因素。结果61例PCa患者中有24例伴NED(39.3%)，NED表达水平随着Gleason评分增加及穿刺前前列腺特异性抗原(prostatespecific antigen，PSA)水平升高而逐渐升高(P＜0.01)，Syn分别与NSE及Cg A表达水平呈正相关性(P＜0.01)。伴NED组PCa患者累积生存率明显低于不伴NED组(P＜0.01)，多因素Cox回归分析显示Gleason评分、NED是PCa患者生存的独立危险因素(P＜0.01)。结论NED与PCa发展及患者不良预后密切相关，是判断PCa患者预后的独立因素。

前列腺癌；神经内分泌分化；嗜铬素A；神经特异性烯醇化酶；突触素

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着老年男性的健康，大部分患者经内分泌治疗后发展为预后不良的激素非依赖性，这与PCa组织中存在神经内分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)密切相关，NED在PCa的生物学行为中起着重要作用［1］。研究发现大部分PCa具有不同程度的NED，而且在低分化、晚期肿瘤中明显增加，但NED可否作为判断激素敏感性PCa的发展及预后的指标仍有争议［2-3］。

局部NED是指经典的PCa中存在单个或小巢样神经内分泌细胞。神经内分泌细胞和非神经内分泌细胞在形态上无明显差异，可应用特异性神经内分泌标志物，如神经特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、嗜铬素A(chromogranin，Cg A)和突触素(synaptophysin，Syn)等进行免疫组织化学表达区分［4］。研究表明，在前列腺神经内分泌癌组织中，NED、Cg A的表达水平与肿瘤的进展密切相关，其表达水平升高是肿瘤诊断及判断预后的重要指标［5］，但这3种特异性NED标志物，特别是Syn在PCa伴NED中的表达率尚有争论［5-6］，有待进一步研究证实。

本研究采用免疫组织化学Max Vision法，检测61例穿刺活检的PCa组织中NSE、Cg A、Syn表达，并分析其表达率与伴局部NED患者各临床病理参数的关系，以明确NED与PCa发展及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集西安交通大学医学院第一附属医院2005年2月～2008年1月间临床病理资料完整、未经任何治疗的61例穿刺活检前列腺癌的石蜡包埋标本，年龄44～83岁，平均(71.52±7.31)岁，中位年龄72岁，其中≥70岁44例，＜70岁17例；活检前血清前列腺特异性抗原(PSA)水平3～1 100 ng/mL，平均(132.26±210.53)ng/mL，中位值71 ng/m L，其中≥20 ng/mL 47例，＜20 ng/mL 14例。其中检出24例PCa伴局部NED，年龄54～82岁，平均(71.83±7.41)岁，中位年龄71.5岁；活检前血清PSA水平3～1 100 ng/m L，平均(135.73±279.33)ng/m L，中位值46.8 ng/mL。另37例PCa(作为对照组)，年龄44～83岁，平均(71.32±7.34)岁，中位年龄72岁；活检前血清PSA水平6.3～756.9 ng/mL，平均(130.01±154.94) ng/mL，中位值100 ng/mL。

1.2 临床病理资料和随访情况复查原HE切片，进行Gleason评分(6分、7分、8～10分)，其中Gleason 6分22例、Gleason 7分21例、Gleason 8～10分 18例，无Gleason 2～5分的病例。临床分期结合国际抗癌协会(UICC)推荐使用的TNM标准，分为：T1～T2期13例、T3～T4期48例，因为是活检标本，因此未作N、M分期。

对所有患者进行随访，截至随访时间为2012年12月31日，随访时间为22～90.5月，中位随访时间为66.3月，平均随访时间(61.29±15.42)月。18例死于肿瘤进展，无因非肿瘤并发症死亡病例。

1.3 免疫组化Max Vision技术检测NSE、CgA和Syn表达免疫组织化学所用一抗、大鼠抗人单克隆抗体NSE、Cg A和兔抗人单克隆抗体Syn及其试剂盒均为即用型试剂，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

组织均为100 m L/L中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，HE染色复查。切片脱蜡、水洗、抗原修复、羊血清封闭、滴加即用型一抗(无需稀释)、PBS洗片、滴加二抗(室温孵育)、DAB显色、苏木精复染核、中性树胶封片。TBS代替一抗作空白对照，用已知肺小细胞神经内分泌癌、PCa及其正常组织作阳性对照。

1.4 免疫组织化学结果判定标准NSE、Syn、Cg A均以细胞质内有棕黄色颗粒为阳性。每例计数500个癌细胞中的阳性细胞数，将阳性细胞按其数量分为3个等级，阳性细胞数在1～10%为(+)，阳性细胞数在11%～50%之间为(⧺)，阳性细胞数＞50%为(⧻)，显色强度与背景无明显差异者为(-)；即(+)为弱阳性，(⧺)为阳性，(⧻)为强阳性，(-)为阴性。

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料采用均数±标准差()表示，组间数据比较采用χ2检验，各标志物免疫组化表达的相关性采用Spearman等级相关分析，标志物的表达与各临床病理参数的关系采用线性χ2检验(Linear-by-linear association)，患者的生存时间采用Kaplan-Meier法分析并绘制生存曲线；多因素生存分析采用多因素COX回归分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCa组织中NSE、CgA、Syn表达及NED的病理特点NSE、Cg A、Syn均表达在细胞质中(图1B、图1C、图1D)。61例PCa组织中NSE阳性(+)25例、(⧺)6例，无强阳性(⧻)表达病例，阳性率50.8%；Cg A阳性(+)21例，(⧺)3例(图1)，无强阳性(⧻)表达病例，阳性率39.3%；Syn阳性(+)4例、(⧺)1例，无强阳性(⧻)表达病例，阳性率8.2%。NSE和Cg A共表达者合计为24例(39.3%)，NSE、Cg A和Syn共表达者5例，并且Syn阳性均出现在NSE与Cg A共表达的病例中，3种均为阴性共30例。NSE和Cg A阳性率差异无统计学意义(χ2=1.622，P= 0.203，P＞0.05)，但NSE与Syn和Cg A与Syn阳性率比较差异均具有统计学意义(χ2=26.638，P= 0.001；χ2=16.330，P=0.001)。

为避免误差可能，采用两种神经内分泌标志物同时阳性者诊断为PCa伴局部NED。在61例PCa组织中总计病理诊断有24例PCa伴局部NED(39.3%)。伴NED癌组织的病理特点是：24例神经内分泌特异性标志物阳性表达的细胞单个散在或呈灶状或片团状分布。细胞大小形态与周围经典的PCa细胞相似，呈立方状或卵圆形，核膜清楚，染色质呈细颗粒状，可见嗜酸性核仁，胞质量多少不等，淡伊红色(图1A)。

图1 PCa伴NED的HE染色病理改变（A）及PCa中NSE、CgA和Syn的免疫组化表达（B、C、D）Fig.1 Morphological patterns in Pca accompanied with NED(A，H&E staining)as well as immunohistochemical detection of NSE，Cg A and Syn(B，C and D)in PCa(×400)

2.2 PCa伴局部NED组织中NSE、CgA及Syn阳性表达的相关性Spearman等级相关分析显示，在PCa伴局部NED组织中，NSE与Cg A、Syn间阳性表达率呈正相关性(NSE与Cg A，rs=0.745，P= 0.000；NSE与Syn，rs=0.453，P=0.001；Cg A与Syn，rs=0.428，P=0.002)，即在PCa中随着NSE表达率升高，Cg A的表达率亦随之升高(P＜0.01)。虽然Syn在PCa中的阳性表达率低，但与NSE阳性表达率之间亦存在正相关关系(P＜0.01)。

2.3 NED与PCa患者临床病理学参数的关系在61例PCa中，PCa伴局部NED的阳性率随着Gleason评分的增加及穿刺活检前血清PSA水平的升高而逐渐升高(P＜0.01)，虽然与不同患者年龄分段及临床分期差异无统计学意义(P＞0.05)，但有升高趋势(表1)。

2.4 生存分析61例患者均获得随访资料，最短随访时间为22个月，截至随访结束时死亡18例，43例均带瘤生存，中位生存时间为66.3个月，累积生存率为70.5%，其中伴有NED的PCa患者中位生存时间为55.2个月，累积生存率为50%。采用Kaplan-Meier法绘制PCa患者的生存曲线，Log-rank检验结果显示伴有NED与PCa患者穿刺活检后累积生存率相关(χ2=12.058，P＜0.01)，即伴有NED的PCa患者生存时间明显缩短，预后更差(图2)。

表1 PCa组织伴发或不伴发NED与临床病理参数的关系Tab.1 Clinicopathological parameters of PCa patients with NED(+ve)and those without NED(-ve)

图2 采用Kaplan-Meier法分析61例PCa患者累积生存情况Fig.2 Survival of PCa patients with or without NED analyzed by Kaplan-Meier method

2.5 预后因素分析将初步筛选出的可能影响预后的因素(患者的年龄、穿刺活检前血清PSA水平、肿瘤Gleason评分、临床分期、NED)引入多变量Cox比例风险回归模型，似然比χ2=24.266，P＜0.01，最终确定NED及肿瘤Gleason评分与患者生存预后有关［NED：回归系数β=1.619，标准误(SE)=0.572，Wald值=8.006，P=0.005，相对危险度Exp(β)= 5.046；Gleason评分：回归系数β=1.640，标准误SE =0.474，Wald值=11.960，P=0.001，相对危险度Exp(β)=5.155］，回归系数＞0，提示NED及肿瘤Gleason评分是PCa患者死亡的高危因素。

3 讨 论

大多数PCa存在局部NED，PCa组织中大部分神经内分泌细胞是以单个或灶状聚集分布，与周围PCa细胞形态无明显差别，可应用免疫组织化学技术检测组织中特异性神经内分泌标志物(NSE、Cg A、SYN等)表达来区分［4］。因此，本研究采用免疫组化方法检测标记物NSE、Cg A、SYN在PCa中的表达，以发现伴发的NED的成分，为避免误差可能，采用两种神经内分泌标志物同时为阳性者诊断为PCa伴NED。本研究结果显示，PCa伴局部NED的阳性率为39.3%，其中NSE阳性表达率较高(50.8%)，是检测NED较敏感的指标，同样Cg A亦有较高的阳性表达率(39.3%)，并且有24例NSE与Cg A共表达。此外，亦显示NSE阳性表达率随着Cg A表达增加而升高，两者呈正相关性；而Syn阳性表达率低(8.2%)，并且均出现在NSE与Cg A共表达的阳性病例中，表明NSE与Cg A联合应用是判定PCa伴局部NED较可靠的指标，支持了ATHER等［6］的观点。而STEIN等［5］研究认为，Syn在神经内分泌肿瘤中表达率高，其敏感性和特异性均较高。总之，Syn阳性表达率仍有争议，需待进一步研究。

近年研究认为，NED对PCa的进展及预后起着重要作用［2］。但越来越多的免疫组织化学和血清学研究表明，NED是激素非依赖性PCa的一项重要的预后指标［7］。PCa神经内分泌细胞可能通过自分泌调节、旁分泌作用促进肿瘤细胞雄激素非依赖性增殖［2］。NED是否能作为激素依赖性PCa的预后判断标准，目前仍有争议。JEETLE等［3］研究发现，与无NED的PCa比较，有NED的PCa患者预后更差，可作为一个独立的判断预后的指标。在本组单因素分析中，具有NED的PCa患者生存时间明显缩短，多因素回归分析证实局部NED与肿瘤Gleason评分同样重要，是影响PCa患者生存的独立的危险因素，是判断PCa患者预后的重要指标。本组结果还显示，PCa伴NED的阳性率随着Gleason评分的增高及穿刺前血清PSA水平的增加而逐渐升高，虽然与患者不同年龄及临床分期的进展无统计学意义，但还是有升高趋势，与FRANCO等［2］的观点一致，进一步证实NED与PCa的进展及患者的不良预后有关。

总之，NED与PCa的发展及患者的不良预后密切相关，是判断PCa患者预后的独立因素。因此，在进行PCa穿刺标本形态学观察时，若有NED成分存在，应在病理报告中加以说明。

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［2］STEFANTA S.Neuroendocrine differentiation in prostate cancer.Prostate cancer：Shifting from morphology to biology［M］. Berlin Germany，Springer，2013：87-109.

［3］JEETLE SS，FISHER G，YANG ZH，et al.Neuroendocrine differentiation does not have independent prognostic value in conservatively treated prostate cancer［J］.Virchows Arch，2012，461(2)：103-107.

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(编辑 国 荣)

Neuroendocrine differentiation in prostate cancer and its correlation with tumor progression and prognosis

HOU Hui-lian，ZHANG Guan-jun，WANG Hong-yan，GONG Hui-lin，YANG Zhe，ZHANG Xue-bin
(Department of Pathology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the relationship of neuroendocrine differentiation(NED)with the progression and prognosis of prostate cancer(PCa).MethodsWe collected 61 prostate specimens on needle biopsy to identify the expressions of NED markers including chromogranin(Cg A)，neuron-specific enolase(NSE) and synaptophysin(Syn)by immunohistochemistry.The relationship of NED with clinicopathological and survival data and risk factors affecting PCa patients'prognosis were analyzed using multivariable Cox regression analysis.ResultsNED was detected in 24 out of 61 patients(39.3%).High NED rate was significantly associated with a high level of prostate-specific antigen(PSA)，high Gleason score and shortened survival time in patients with PCa (P＜0.01).Syn positively correlated with NSE and Cg A expression level，respectively(P＜0.01).Cumulative survival rate was significantly lower in PCa patients with NED than in those without.Multivariable Cox regression analysis showed NED and Gleason scores were independent factors affecting the survival of PCa patients(P＜0.01).ConclusionThe Results suggest that NED is closely associated with poor prognosis and progression of PCa；therefore，NED is an independent factor for evaluating the prognosis of PCa.

prostate cancer(PCa)；neuroendocrine differentiation(NED)；prognosis；chromogranin(Cg A)；neuron-specific enolase(NSE)；synaptophysin(Syn)

R973.25

A

1671-8259(2014)05-0674-04

10.7652/jdyxb201405021

2014-01-13

2014-04-12

陕西省科技攻关资助项目(No.2012K13-02-04) Supported by the Science and Technology Research Project of Shaanxi Province(No.2012K13-02-04)

侯惠莲(1964-)，女(汉族)，博士，副教授.研究方向：前列腺肿瘤病理.E-mail：hhlsnl@sina.com

时间：2014-07-22 16∶24 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1624.008.html