携带NRPS基因的新疆嗜盐放线菌抑菌活性筛选

张 飞 吕玲玲 万传星 张利莉*

放线菌一直是抗生素的重要来源。在放线菌中抗生素生物合成途径已经进化了大约10亿年，它的适应性早就通过其穿透其它微生物并抑制其靶酶、大分子以及大分子结构形成的能力表现出来，因此从放线菌中发掘新的抗生素一直是人们关注的焦点，目前临床上应用的抗生素约三分之二来源于链霉菌属［1－2］。普通环境的放线菌中发现新型抗生素越来越困难，人们逐渐把目光转移到其他环境，特别是对海洋和极端环境中放线菌的深入研究，认为极端环境中的放线菌具有发现新型抗生素的巨大潜能［3］。嗜盐放线菌是极端微生物的重要组成部分，它们通常生活在盐湖、盐碱地、海水等高盐环境中，是一类极具应用前景的微生物资源［4］。Kokare等人发现的嗜盐放线菌株AH1可以抑制细菌Staphylococcus aureus、Staphylococcus 。epidermidis和Bacillus subtilis的生长［5］。新疆盐碱环境蕴藏着丰富的嗜盐放线菌，具有发现新型抗生素的巨大潜能。

抗生素筛选模型有传统筛选模型、特定筛选模型以及高通量筛选模型，传统筛选模型被称为是抗生素产生菌与活性物质的双重筛选，其样品为菌株发酵液或发酵液粗提物，成分复杂，筛选过程耗时长，效率较低，且有一定盲目性［6］。然而随着基因组研究的深入，各种基因工程手段，遗传学手段以及分子细胞学方法的出现，使得天然来源的新抗生素的筛选技术，已经逐渐从随机筛选程序向“定向筛选”转变。本研究以经典筛选方法为依据，以分离于新疆盐环境放线菌为供试菌，在实验室对新疆盐环境放线菌研究的基础上，选取携带有NRPS基因的放线菌，对发酵液进行抑菌活性筛选，以期得到具有抗生素产生潜能的放线菌。

1 材料

1.1 实验仪器与试剂

仪器:旋转蒸发仪(Eyela，日本)，恒温培养箱(Boxun，上海)，移液器(Eppendorf)，摇床(Boxun，上海)，高速台式离心机(Gl－20G－Ⅱ，上海安亭科学仪器厂)，超净工作台(Boxun，上海)。

试剂:石油醚，氯仿，乙酸乙酯，甲醇均为国产分析纯试剂，购于天津市福晨化学试剂厂。

1.2 实验菌株

供试菌:48株供试菌由本实验室提供，均为耐盐菌(1% ～15%)，包括轻度和中度嗜盐菌。其中轻度嗜盐菌7株，中度嗜盐菌25株，极端嗜盐16株。

靶标菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus pidermidis ATCC35984)分别由浙江医学院和上海复旦大学提供，大肠杆菌(Escherichia coli7－5)由塔里木大学动物科学学院提供。白色念珠菌株标准菌 Candida albican ATCC64550，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，白色念珠菌临床株:Candida albican 09－1555，Candida albican 09 －1634，Candida tropicalis 032，Candida krusei09－1681，由华中科技大学同济医学院协和医院提供，分别分离于阴道、粪便、咽喉拭子等部位。

1.3 培养基

ISP－4培养基:淀粉 10.0 g，(NH4)2SO44.0 g，CaCO31.0 g，MgSO42.0 g，K2HPO42.0 g，琼脂18.0 g，Nacl 1.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0 ～7.5。

SDA 培养基:葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂20.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0。

LB培养基:胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂 18.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

TSB 培养基:TSB 30.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

玉米粉培养基:每升水含玉米粉15.0 g(煮沸20 min，四层纱布过滤用其滤液)，葡萄糖 10.0 g，CaCO31.0 g，NaCl(根据不同菌株最适盐浓度添加)，蛋白胨 5.0 g，H2O 1 000 mL，pH 7.5，121 ℃，高压蒸汽灭菌30 min。

2 实验方法

2.1 供试放线菌发酵液的制备

先将供试放线菌涂布于ISP－4固体培养基上，涂布量为每板35μL。37℃恒温培养数日，待菌株长出。将长出的菌体再次接种到液体ISP－4培养基中37℃，200 r/min震荡培养培养4 d制成种子液。然后将种子液接种到玉米粉培养基中，接种量为2 mL/200 mL，37℃，180 r/min震荡培养 7 d得到发酵液，8 000 r/min离心10 min得上清液。

2.2 发酵液的萃取与生物活性测试

将处理过的发酵液按1:1的体积比乙酸乙酯萃取三次，用旋转蒸发仪减压浓缩后得到乙酸乙酯相和水相，水相干燥后再次用甲醇超声溶解，减压浓缩后得到甲醇相。甲醇相用“M”表示，乙酸乙酯相用“E”表示，4℃冰箱保存待用(过程如下)。

图1 不同菌株发酵液两种萃取相对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

图2 不同菌株发酵液两种萃取相对表皮葡萄球菌的抑菌效果

图3 菌株发酵液甲醇萃取相对大肠杆菌抑菌效果

3 结果与分析

本实验测定了48株携带NRPS基因的嗜盐放

2.3 抗菌活性测试方法

图4 不同菌株发酵液两种萃取相对白色念珠菌的抑菌效果

牛津杯法又称管蝶法［7］。以金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌为靶标菌。将靶标菌接种于相应液体培养基中:金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌接种于液体TSB培养基中，大肠杆菌接种于液体LB培养基上，念珠菌接种于液体SDA培养基上，37℃恒温培养24 h获得靶标菌菌悬液，取35μL菌悬液分别涂布于相应固体培养基平皿上，制成靶标菌指示平皿，每种靶标菌设置3个重复，将灭菌的牛津杯轻轻放入制好的指示平皿上。再将甲醇相和乙酸乙酯相萃取物配制成0.1 g/mL的稀释液，然后每个杯中加入200μL稀释液，37℃恒温培养24 h，观察结果，测量抑菌圈，计算平均值［8］。线菌发酵液的抑菌活性，并从中筛选出18株活性菌株，其中抗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的有15株(图1－2)，抗大肠杆菌的有3株(图3)，抗白色念珠菌的有11株(图4);18株拮抗菌中放线多孢菌(Actinopolyspora)9株， 拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)5株，链霉菌(Streptomyces)4株(表1)，均为新疆嗜盐放线菌的优势菌群。18株拮抗菌中有13株菌的最适盐浓度在5% ～10%之间，属于中度嗜盐菌，其中Actinopolyspora 7株，Nocardiopsis 4株，Streptomyces2株，3株轻度嗜盐菌和2株极端嗜盐菌。18株拮抗菌有16株含有两种以上抗生素合成基因。

从图1可以看出抗金黄色葡萄球菌的菌株发酵液活性部位不仅存在于甲醇萃取相也在于乙酸乙酯萃取相。13株抗金葡菌的拮抗菌中，甲醇相有抗性的有2株分别为TRM 45542和TRM 46033;乙酸乙酯相有抗性的有7株;甲醇相和乙酸乙酯相都有抗性的有3株。图2显示在抗表葡菌的8株拮抗菌中，有5株菌的活性部位在乙酸乙酯相中，2株菌两相都对表葡菌有抗性。图3显示的是3株菌对大肠杆菌的抗菌效果，这3株菌中只有甲醇相的发酵液萃取相对大肠杆菌有抑菌作用。图4是10株菌发酵液两种萃取相对白色念珠菌的抑菌效果，除菌株TRM 45301外其余9株菌的活性部位都在甲醇相。

携带NRPS功能基因的菌株都有抗革兰氏阳性菌和真菌的潜能，原因是NRPS基因能调控放线菌产成多肽类抗生素，如青霉素、万古霉素和环孢菌素A等，这些多肽类抗生素大多以环化为主，且结构稳定功能特殊，在抗G+特别是抗耐药菌上发挥着巨大的作用，比如万古霉素是抗MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)的首选药物［9－11］。但实验结果表明携带有NRPS基因的菌株的抑菌几率只占到34.6%，另外的63.4%未能表达出抑菌活性，可能是发酵过程中未能激发出功能基因的表达，导致了基因沉默。也有可能是NRPS基因在表达时有底物选择性，而所用的发酵培养基未能提供这些底物，导致其不能产生相应的代谢产物［12］。在所有活性菌株中含有两种以上功能基因的菌株有16株，其中以含有PKS－Ⅰ和NRPS的菌株居多，因此从含有两种以上抗生素合成基因的菌株中筛选活性菌株的几率比含有一种基因的几率高。

功能菌株发酵液的抑菌部位不仅存在于甲醇萃取相也在于乙酸乙酯萃取相，抑菌部位在乙酸乙酯萃取相中的菌株较甲醇相多，所以可以用乙酸乙酯萃取发酵液的方法对菌株活性成分进行分离纯化，从嗜盐菌的最适盐浓度发现，拮抗菌大部分都属于中度嗜盐菌，拮抗菌半数的放线多孢菌是中度嗜盐菌，可见在新疆嗜盐放线菌的抑菌筛选中，链霉菌并非是主要的的菌株来源，携带有抗生素合成基因的嗜盐放线多孢菌筛选几率更大。

表1 18株拮抗菌的种属及抗生素合成基因信息

续表1 18株拮抗菌的种属及抗生素合成基因信息

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