口蹄疫病毒外源序列插入位点的研究进展

张岩，胡永浩，杨帆，郑海学 甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原学国家重点实验室 口蹄疫国家参考实验室，甘肃 兰州 730046

口蹄疫病毒外源序列插入位点的研究进展

张岩1，胡永浩1，杨帆2，郑海学2
1 甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070 2 中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原学国家重点实验室 口蹄疫国家参考实验室，甘肃 兰州 730046

伴随着对口蹄疫病毒 (FMDV) 蛋白结构功能的深入研究，发现FMDV能够表达外源基因片段。通过对FMDV的基因进行改造和修饰研究，进而实现了不同应用目的，如提高病毒滴度、引入标记、提高免疫应答、降低致病性等。文中主要从FMDV接受外源基因插入位点角度来介绍现阶段关于FMDV表达外源基因相关进展。

口蹄疫病毒，外源基因，插入位点

口蹄疫 (Foot and mouth disease，FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot and mouth disease virus，FMDV) 引起的一种高度传染性疾病，主要感染偶蹄动物 (主要是牛、猪和羊等)。不仅对畜牧养殖业造成严重的经济损失，也对畜产品的国际贸易带来巨大的负面影响[1-2]。

FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有7种血清型，包括A、O、C、Asia 1和SAT 1、2和3。FMDV基因组为单股正链RNA，病毒基因组由8 500个碱基左右组成，RNA被衣壳包裹，其正二十面体衣壳由4种结构蛋白VP1-VP4各60 份拷贝构成。FMDV翻译成1个多聚蛋白，该多聚蛋白被蛋白酶裂解成结构蛋白 (VP1、VP2、VP3和VP4) 和非结构蛋白 (L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3Dpol)[2]。目前反向遗传学技术在FMDV研究中应用广泛，国内外很多学者利用反向遗传学在FMDV基因组上插入外源基因的方法来研究FMDV的复制和感染过程，并在这一方面取得了较大的进展。

在病毒上引入标记，然后检测标记来确定病毒不同时期的状态是研究病毒中常用的方法，同时也有在病毒上引入外源基因将病毒作为载体用于应用研究。因此病毒能够接受外源基因插入的位点是首要解决的问题。接下来我们从现阶段FMDV能够表达外源基因的区域来进行详细介绍。

1 前导蛋白L区引入外源基因片段

FMDV的前导蛋白L蛋白具有木瓜样蛋白酶特性。FMDV可以识别两种密码子，因而具有两种编码产物Lab和Lb。两种形式的蛋白酶均能够降解宿主细胞的翻译起始因子eIF4G，从而抑制宿主“帽子”依赖性的mRNA翻译，导致宿主表达干扰素的水平降低，进而抑制宿主免疫应答[3]。由于L蛋白在FMDV逃避宿主免疫方面的特性，L蛋白对于FMDV的重要性不言而喻。1995年Piccone等[4]发现FMDV L蛋白的基因在病毒复制过程中并不是完全必需的，当保留了编码L蛋白序列Lab和Lb的AUG之间的84 nt碱基就能保持病毒的活性。在1996年Brown等[5]在研究L蛋白缺失FMDV毒力时，通过感染牛发现L蛋白缺失的病毒致病性相比原毒有所下降。Piccone等[6]在2010年成功拯救出3株含有外源片段的L蛋白缺失重组FMDV，后续的动物实验证实了L蛋白在参与感染过程的重要性。2011年Piccone等[7]在L蛋白的Lab和Lb之间引入了一个含有酶切位点的氨基酸序列，然后在该位点依次引入流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)、Flag和TC标签，构建了3株重组病毒 (图1)。在成功拯救出病毒后，在细胞水平检测到了重组病毒中外源片段的表达。这证明了编码L的蛋白区域具有携带和表达外源片段的能力。对L区进行反向遗传操作也是降低致病性提高生物安全性的重要途径，作者研究团队利用突变L基因抑制天然免疫的功能性位点，获得了对宿主动物无致病性、不排毒以及免疫应答快的重组FMDV。

图1 FMDV全基因及构建质粒简图[7]Fig. 1 Schematic diagram of the FMDV genome and plasmids used in this study[7].

2 VP1区引入外源基因

FMDV的VP1表面存在一个被高度保守的Arg-Gly-Asp (RGD) 修饰的环状结构，经研究发现这个特殊的环状结构能够被细胞表面的αν整联蛋白的家族受体 (ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8)所识别[8-11]。研究表明多种血清型的FMDV VP1的G-H环结构同时也是一个抗原位点[9,12-13]。VP1的G-H环状结构可以利用胰蛋白酶水解的方法除去，在除去VP1的G-H环结构后导致FMDV的毒力下降了许多[13-14]。

2012年Wang等[15]在研究VP1的G-H环结构对FMDV复制的影响时，在Asia 1型FMDV上G-H环状结构中插入了O型FMDV的保护性中和表位，获得的重组病毒具有诱导产生两种血清型中和抗体的能力。同年Lawrence等[16]在VP1的G-H环结构上成功插入了一个Flag标签(DYKDDDDK)。因为G-H环是一个柔性的环状结构，为了最小限度地影响VP1的空间构型，Lawrence对插入Flag的序列进行了调整，将DKYDDDDK替换成DYKDDDDK。蚀斑实验表明VP1插入标签后FMDV的毒力下降。通过免疫荧光反应，检测到Flag和VP1的表达。

Seago等[17]在2012年研究VP1 G-H环结构发生改变对FMDV特性影响时，在RGD下游即VP1的155–156位氨基酸中插入了HA和Flag标签。含有标签的重组病毒可以利用主要的整连蛋白受体，重组病毒的蚀斑与亲本病毒相似，但毒力也存在一定程度的下降。VP1的G-H环状结构的上游和下游均存在插入位点，用于表达外源片段。由于G-H环状结构对FMDV比较重要，可能影响到病毒抗原性和吸附能力，所以此区域能接受外源片段的大小值得探索。

3 VP1区与2A蛋白区之间引入外源基因

FMDV的2A蛋白具有自我剪切功能。在FMDV复制的过程中，2A蛋白从C端开始将大部分的衣壳蛋白从非结构蛋白上切下，再由3C蛋白酶进一步对多聚蛋白进行水解。鉴于2A的特性，有学者一直尝试利用这种特性在此位置进行反向遗传操作。

2013年Seago等[18]在VP1区末端2A蛋白前，插入了大分子的标记荧光蛋白。其构建了2株重组病毒引入720 nt的绿色荧光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 和933 nt的海肾荧光素酶 (Renilla luciferase，RL)。Seago等实验的最初目的是在此区域表达GFP和RL，但是重组病毒感染山羊上皮细胞的结果显示，3代以后细胞就不再出现病变了，也无法通过共聚焦观察到GFP和RL的荧光。为了进一步研究此区域能接受外源基因的大小，Seago等在原位点处插入了外源片段构建了6株重组病毒 (外源片段大小依次为105 nt、204 nt、303 nt、417 nt、504 nt和609 nt)。实验结果显示插入外源片段小于300 nt的病毒能够稳定传代并能从中检测到插入基因，蚀斑实验也显示出了与亲本病毒相近的毒力。这说明在此VP1末端和2A蛋白区之间，FMDV能够容纳较大的外源片段，这对FMD研究是一个新的突破。

4 3A蛋白区引入外源基因

FMDV与其他小RNA病毒不同，它有更长的3A蛋白。研究发现3A蛋白是使用物理方法与细胞内膜结合，但在FMDV感染细胞和复制的过程中3A非结构蛋白的功能并没有被很好认识[19-20]。然而在3A蛋白发生变化时，这些变化都会导致宿主的特异性、适应性或毒力发生改变[21-23]。如Taiwan97毒株是因为3A92-102位氨基酸缺失导致对牛的致病性下降。2012年Li等[24]用Flag标签和编码单纯性疱疹病毒 (HSV) D蛋白的抗原表位 (QPELAPEDPED)，替换了3A中第92～102位氨基酸，并且成功拯救出两株重组口蹄疫病毒。实验结果显示重组病毒的毒力和复制动力学与原毒相近。经检测发现在口蹄疫病毒3A处替换的FLAG与HSV抗原表位都能够持续稳定地表达。

5 3B蛋白区引入外源基因

FMDV具有3个相似但不完全相同的3B蛋白 (3B1-3) 或VPg (VPg1-3)，长度在23–24个氨基酸左右。FMDV 3B蛋白对病毒感染力影响不大，但分离的野毒都完整地保留了3B结构，这一结构有可能与FMDV进化过程中选择压力有密切关系[25]。也有实验证明3B3是FMDV 3Dpol最有效的底物[26]。Falk和Pacheco[27-28]的研究表明，当FMDV存在3B3时才具有感染性，若仅有3B1或3B2则会导致病毒失活。2010年Arias等[29]在研究3B的缺失与突变与细胞病变关系时，构建了4株仅有单一3B拷贝的重组病毒，其中还包含2株由3B1和3B2重组的嵌合病毒 (图2)。结果显示不含3B3结构以及未保留3B3末端9 位氨基酸的2株重组病毒无法稳定复制。这个实验精确定位了3B3结构中对于FMDV复制有影响的氨基酸，从而证明3B3结构对于FMDV复制的重要性。

2010年Pacheco等[30]在研究3B与FMDV培养特性和对牛的致病性实验中构建了5株重组病毒。其中3株是在3B1、3B2和3B3分别随机地插入了19个氨基酸的序列，另外2株在保留了3B3后删除了部分序列。5株重组病毒均拯救成功，然后对其毒力、复制能力以及各项生物学特性进行了检测，最后与亲本病毒进行比较，发现重组病毒的各项生物指标与亲本病毒基本保持一致。2012年Uddowla等[31]在研究FMD负标记疫苗的时候，对FMDV全长cDNA克隆进行了多点突变和片段的缺失。其中包含在3B2的部分氨基酸进行缺失后替换，构建了多株重组病毒，并且成功拯救出了构建的FMDV。动物实验发现构建的重组病毒并没有产生稳定的中和抗体，同时诱导的抗体没有产生预期的交叉保护现象，但不同毒株诱导的抗体可以区分。

图2 嵌合VPg的构建简图[27]Fig. 2 Schematic representation of the constructions with one copy of VPgs[27].

鉴于3B的特殊结构，这一区域一直是FMDV反向遗传操作的区域。该区域作为FMDV载体的插入位点是值得深入研究的。作者所在团队正在进行3B不同位置插入大片段基因的研究，如果突破将进一步推进FMDV表达插入基因大小的问题。

6 展望

FMDV基因序列上存在多个位点可以稳定表达插入的外源基因，在利用反向遗传学进行操作时，病毒的可控性很高。FMDV感染细胞时细胞病变快，复制滴度高，使得FMDV能够高效表达外源基因。这两点说明FMDV具有病毒载体的潜质。但FMD作为病毒载体面临两个问题：第一是毒株的安全性；第二是病毒能够表达外源基因的大小。这两点限制了口蹄疫病毒作为病毒载体的应用。

FMDV容易变异，这对FMD的防控十分不利，所以要将FMDV作为载体，稳定的弱毒株是关键。目前许多学者都在尝试将FMDV弱化，不仅能够作为载体，如果毒株稳定性强可以直接制成弱毒苗疫苗。致弱的FMDV载体是未来研究的一个热点方向。有研究通过对病毒基因组进行改造在保证其活性的前提下降低其毒力，如L蛋白的SAP结构突变毒株，发现感染动物后无临床症状也没有排毒带毒现象，并能产生有保护性的抗体[3,32-33]。目前我们实验室利用反向遗传技术已经成功构建了病毒滴度高、抗原匹配性好、免疫保护力强的疫苗株[34]。目前现阶段有关FMDV表达外源基因的报道大都是小片段标记。Seago等[18]的研究为FMDV表达大的外源片段方面带来了新的突破，但现阶段关于FMDV作为载体插入大片段仍不成熟，尚不能在技术水平达到其他病毒载体的水平 (如：如腺病毒、杆状病毒和痘病毒等)。因此FMDV基因组承载外源片段的能力也是FMDV研究的又一重点。

国内外一直致力于FMDV的研究，旨在有效控制FMD的流行。通过引入外源基因对FMDV进行改造可以解决很多现阶段FMD防控的问题。如：我国控制FMD的主要手段是通过免疫灭活疫苗，由于在实际防控中FMD疫苗的多次免疫会造成感染抗体与疫苗免疫抗体难以区分的问题。我们在FMDV基因组引入标记，然后配套相关标记检测试剂，在理论上是完全可以鉴别野毒感染抗体和免疫抗体。未来可以在FMDV中引入一些免疫因子的基因，如：树突状刺激因子的基因，这能改善免疫原性提高免疫效果。还借助FMDV的复制滴度高，在FMDV上引入外源基因进行高效表达。在FMD疫苗株上导入其他病原的主要抗原基因生产出双价苗，能达到一苗防两病的效果，同时简化养殖场的免疫程序。

FMDV插入外源基因的研究是十分具有潜力的，无论是应用研究还是基础研究都能使用到相关技术，这为FMDV研究提供了一个新思路。

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(本文责编 陈宏宇)

Progress in insertion sites for foreign sequence of foot and mouth disease virus

Yan Zhang1, Yonghao Hu1, Fan Yang2, and Haixue Zheng2
1 College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China 2 National Foot and Mouth Disease Reference Laboratory, State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, Gansu, China

With the progess in studying gene structure and function of foot and mouth disease virus (FMDV), FMDV canexpress exogenous genes in different sites. Through transforming and modifying FMDV can achieve different application purposes such as improving virus titer, introducing tag, improving immune responses, and reducing pathogenicity. From the perspective of FMDV receiving inserted exogenous gene, this paper mainly describes the latest relevant developments of FMDV’s expression to exogenous gene.

foot and mouth disease virus, exogenous gene, insertion site

May 2, 2013; Accepted: July 16, 2013

Yonghao Hu. Tel/Fax: +86-931-7631220; E-mail: yhh0817@126.com Haixue Zheng. Tel/Fax: +86-931-8342086; E-mail: haixuezheng@163.com

张岩, 胡永浩, 杨帆, 等. 口蹄疫病毒外源序列插入位点的研究进展. 生物工程学报, 2014, 30(2): 175-181.

ZhangY, Hu YH, Yang F, et al. Progress in insertion sites for foreign sequence of foot and mouth disease virus. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 175-181.

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A211-1), the High-level Technological Talent Program of Gansu Province (No. 1013JHTA008), the International Atomic Energy Agency (No. 16025/R0), China Agriculture Research System (No. CARS-39).

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时间: 2013-08-16 网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130816.1711.002.html