脑室内注射瘦素对四肢骨折愈合的影响*

刘保龙 孙志明 武俏丽 王 宏 闫 华△

脑室内注射瘦素对四肢骨折愈合的影响*

刘保龙1孙志明2武俏丽2王 宏2闫 华2△

目的 观察兔胫腓骨骨缺损模型脑室内注射瘦素蛋白（leptin）对骨折愈合速度的影响。方法建立新西兰兔右侧胫腓骨外侧骨缺损模型，leptin组经兔枕骨大孔向小脑延髓池脑脊液中注射重组兔leptin，对照组以相同方法注射等剂量生理盐水。于术后1、3、7、14、21 d记录兔体质量变化，并通过CT动态记录骨缺损区域骨痂骨密度（BMD）的变化。于术后21 d，所有动物均处死后取右侧胫腓骨骨缺损区域，以荧光原位杂交技术(FISH)检测骨折区域骨形成蛋白（BMP）-2的表达情况。结果2组动物造模后，体质量先下降后（14 d）上升，BMD一直呈上升趋势；术后1、3 d，2组体质量及BMD差异均无统计学意义，术后7、14、21 d，leptin组的体质量低于对照组，BMD高于对照组（均P＜0.05）。术后21 d，骨缺损区域BMP-2表达阳性细胞数目高于对照组(个：120.87±29.14 vs 97.65±20.97,t=6.79, P＜0.001)。结论经枕骨大孔向小脑延髓池内中注射leptin可加速兔四肢骨缺损的愈合。

瘦素；脑脊液；胫骨骨折；骨折愈合；骨密度；原位杂交，荧光；兔；骨形成蛋白2

颅脑创伤合并四肢骨折多呈现四肢骨折骨痂体积较大，愈合加快[1]，甚至异位骨化的现象[2-3]，提示四肢骨折合并颅脑损伤时多伴随成骨作用增强。颅脑创伤是一种严重的创伤性疾病，可引起复杂的生理状态包括代谢、循环、呼吸以及免疫状态的改变。Cadosch等[4]提出颅脑创伤相关性异位骨化可能是颅脑创伤后引起的循环血液中某些生长因子的改变间接作用导致的。本课题前期研究发现，脑外伤后兔血清中瘦素（leptin）、生长激素（GH）、胰岛素样生长因子（IGF）-1等激素显著升高，升高的leptin可能是由于外伤引起血脑屏障破坏而渗漏进入脑脊液中所致[5]。本实验通过建立单纯四肢骨缺损模型，经枕骨大孔向小脑延髓池中注射重组兔leptin来提高脑脊液中leptin水平，以此观察脑室内leptin水平升高对四肢骨折愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 重组兔leptin（以色列prospec）、牙科钻、操作台、器械以及麻醉药均由天津市脑血管病与神经变性重点实验室提供。

1.2 实验动物和分组 新西兰白兔20只，雄性，4月龄，平均2.5 kg（购自天津市奥易实验室），在安静、温暖、避强光的环境中饲养，严格控制日夜更替时间，每天均给予相同进食量（200 g）和足量饮用水，并保持环境清洁与卫生。采用抽签法将动物随机均分为2组，leptin组：建立骨缺损模型后于1、3、7 d经枕骨大孔向小脑延髓池注射leptin（0.5 g/L溶于生理盐水），对照组建立骨缺损模型后以相同时间点及方式注射等量生理盐水。本研究对动物的处理方法符合动物伦理学要求。

1.3 建立兔右侧胫腓骨缺损模型 新西兰兔全麻满意后，于右侧胫腓骨中上1/3处，用牙科钻打磨骨性缺损（长∶宽∶高= 3 mm∶2 mm∶2 mm，深度均未达骨髓，以免造成骨髓感染影响实验结果），造模过程中严格注意无菌操作，防止术后出现感染影响实验结果，术后骨缺损模型均无需外固定。

1.4 观察指标 于术后1、3、7、14及21 d记录并分析兔体质量变化；相同时间点于CT下扫描兔右胫腓骨缺损区域，以查看其骨痂愈合情况及骨密度（BMD）变化；第21天，处死所有动物并取其右侧胫腓骨，用荧光原位杂交(FISH)法测定骨形成蛋白（BMP）-2(探针5′-GAAGCACGCGGGGACACGTC CATTGAAAGA-3′，5′-AGCAACCGCAACTCGAACTCGCTCAGGATG-3′)表达情况，以红色荧光为阳性，以每个视野的阳性细胞个数来表示BMP-2的表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0录入数据并行统计学分析，数据以±s表示，比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同时间点2组体质量变化情况 2组动物造模后均出现体质量下降，于第14天开始上升；术后1、3 d，2组体质量差异无统计学意义，术后7、14、21 d，leptin组的体质量低于对照组（P＜0.05），见表1。

Table 1 Weight change in leptin group and control group表1 不同时间点2组体质量比较（n=10,kg，ˉ±s）

Table 1 Weight change in leptin group and control group表1 不同时间点2组体质量比较（n=10,kg，ˉ±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表2同

组别leptin组对照组t术后1 d 2.57±0.07 2.60±0.04 0.75术后3 d 2.45±0.10 2.54±0.06 1.94术后7 d 2.32±0.09 2.51±0.07 4.02＊术后14 d 2.38±0.05 2.65±0.04 11.19＊＊术后21 d 2.52±0.05 2.70±0.03 7.10＊＊

2.2 不同时间点2组骨痂BMD变化情况 2组术后BMD均呈上升趋势，术后1、3 d，2组间BMD差异无统计学意义，术后7、14、21 d，leptin组的BMD高于对照组（P＜0.05），见表2。

2.3 右侧胫腓骨缺损区域BMP-2的表达情况 leptin组的BMP-2阳性细胞数目高于对照组(个：120.87±29.14 vs 97.65±20.97，t=6.79，P＜0.001)，在leptin组中可见到大量阳性表达的软骨细胞和成骨细胞，见图1；对照组仅可见少量BMP-2阳性表达细胞，见图2。

Table 2 BMD in leptin group and control group表2 不同时间点2组BMD比较（n=10,mg/cm2，ˉ±s）

Table 2 BMD in leptin group and control group表2 不同时间点2组BMD比较（n=10,mg/cm2，ˉ±s）

组别leptin组对照组t术后1 d 817.62±15.96 818.93±13.31 0.16术后3 d 844.52±17.13 850.23±17.93 0.57组别leptin组对照组t术后7 d 906.73±19.28 869.63±19.72 3.29＊术后14 d 1 092.12±10.22 1 000.47±25.29 8.23＊＊术后21 d 1 184.83±29.36 1 052.43±13.70 10.01＊＊

Figure 1 BMP-2 expression in leptin group(FISH,×50)图1 leptin组骨缺损区域BMP-2表达情况(FISH,×50)

Figure 2 BMP-2 expression in control group(FISH,×50)图2 对照组骨缺损区域BMP-2表达情况（FISH,×50）

3 讨论

Leptin是主要由脂肪组织分泌的分子质量为16 ku的蛋白类激素，可以通过外周作用或中枢作用来调节脂类代谢、食欲以及性腺的发育[6]，但leptin在脑脊液中对骨代谢的作用仍存在争议：一些研究发现向正常大鼠脑室内注射leptin后导致骨量下降；与此相反，有研究者通过向leptin缺陷大鼠脑室内连续注射leptin后，发现其BMD、骨矿物质含量、骨体积以及骨矿物质沉积率均提高[7]。Hamrick等[8]研究发现，不同类型骨质（长骨、短骨、扁骨及不规则骨）对中枢leptin的反应不同。

本实验选择兔右侧胫腓骨中上1/3处骨缺损性骨折来观察骨折愈合过程，可以减小骨折模型建立过程中骨折程度不一带来的差异，且该骨性缺损可以在不损伤兔正常运动功能的同时自行愈合，而不会出现骨缺损不愈合的现象。由于中枢leptin可以通过下丘脑抑制进食，因此对于leptin组和对照组均给予等量食物喂养以消除leptin组因中枢leptin的抑制进食作用而产生的能量摄入不等对骨折愈合的影响。

骨折愈合情况与骨折区域钙化程度及胶原蛋白质量、显微结构等有关。骨折区域的BMD能够说明骨痂钙化程度，影响BMD的因素包括体质量、营养状态以及成骨活性等。本研究发现在骨缺损愈合过程中，早期2组动物均出现体质量下降，考虑为建立骨缺损模型后应激反应导致，然后在7～21 d leptin组的体质量下降更为明显，进一步印证了中枢leptin抑制进食、促进能量代谢的作用。2组术后骨痂BMD均呈上升趋势，是因为骨缺损愈合引起钙盐沉积及相应骨折愈合反应导致，leptin组自第7天开始骨缺损区域骨痂BMD显著高于对照组，原因是注射leptin后，骨缺损的修复加快，骨密度显著升高，成骨活性增强。

BMP-2是BMPs家族中的一种，是转化生长因子(TGF)-β超家族中的一组多功能细胞因子,具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化,最终导致软骨、骨形成的作用。本研究发现，leptin组骨缺损愈合过程中第21天的骨痂区域BMP-2表达高于对照组，证明了leptin组骨折愈合作用的增强。在骨折愈合过程中，骨量的稳定通过不断的成骨细胞的成骨作用和破骨细胞的溶骨作用来维持，而在整个过程中，骨成形蛋白家族BMPs在骨代谢过程中起着重要的作用，且与异位骨化存在一定联系：BMPs在不同状态下可以诱导间充质干细胞分别分化为骨细胞、软骨细胞、韧带及肌腱[9]。

本实验通过向脑室中注射leptin干预兔胫腓骨骨缺损模型，发现leptin在中枢作用可以增强骨折愈合过程中的成骨活性。leptin在中枢加强成骨活性的具体通路及机制尚未明了，其存在以下几种可能：（1）中枢leptin通过作用于下丘脑-垂体内分泌轴来影响体内激素水平（GH，IGF-1，碱性磷酸酶等），从而进一步调节四肢骨折愈合进程。（2）中枢leptin可能通过影响中枢神经系统神经元活性使其产生同神经损伤类似的反应，释放某种生物因子进而影响成骨活性，加快骨折愈合、骨痂形成，甚至形成异位骨化。leptin中枢的成骨作用具体途径仍需进一步研究。

[1]Yang TY,Wang TC,Tsai YH,et al.The effects of an injury to the brain on bone healing and callus formation in young adults with fractures of the femoral shaft[J].J Bone Joint Surg Br,2012,94(2): 227-230.doi:10.1302/0301-620X.94B2.28193.

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[3]van Kampen PJ,Martina JD,Vos PE,et al.Potential risk factors for developing heterotopic ossification in patients with severe traumatic brain injury[J].J Head Trauma Rehabil，2011，26(5):384-391.doi: 10.1097/HTR.0b013e3181f78a59.

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（2014-04-01收稿 2014-04-10修回）

（本文编辑 闫娟）

Effect of Intracerebroventricular Leptin Injection on Limbs Fracture Healing

LIU Baolong1，SUN Zhiming2，WU Qiaoli2，WANG Hong2，YAN Hua2
1 Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China；2 Department of Neurosurgery,Huanhu Hospital of Tianjin

Objective To investigate the enhanced osteogenesis during bone fracture healing after intracerebroventricular(ICV)leptin injection,using rabbit model with created segmental bone defect in right tibial.MethodSegmental critical-sized defects were created at the right tibial bone of skeletally mature New Zealand white rabbits.In experiment group(leptin group),recombinant rabbit leptin was injected into cerebellomedullary cistern through foramen magnum.While in control group,normal saline was injected in the same way.Bone Mineral Density(BMD)was evaluated by qCT at 1st,3rd, 7th,14th and the 21st days.At the 21st days,all rabbits were euthanized to collect the right tibia for histomorphology,to examine the BMP-2 expression in the bone callus by Fluorescence in situ hybridization(FISH).ResultIn the leptin group, body weight declined more obviously than control group then it start to arise at the 14th day;qCT showed significant higher BMD in leptin group than in control group at the 7th day;FISH showed a higher BMP-2 expression in leptin group than in control group.ConclusionCerebellomedullary leptin injection through foramen magnum could accelerate limb fracture healing in rabbit model with right tibial bone defection.

leptin;cerebrospinal fluid；tibial fracture;fracture healing；bone density;in siut hybridization,fluorescence;rabbits;bone morphogenetic protein 2

R683.4

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.013

*天津市科学技术委员会基金课题（项目编号：13JCYBJC21100）；天津市卫生局攻关课题(项目编号：10KG208)

1天津医科大学研究生院(邮编300070)；2天津市环湖医院神经外科

△通讯作者 E-mail：liubaolong1988@gmail.com