五味子醇提液对阿霉素损伤足细胞中nephrin和desmin表达的影响*

艾 辰 谭小月 张勉之 张大宁

五味子醇提液对阿霉素损伤足细胞中nephrin和desmin表达的影响*

艾 辰1谭小月2张勉之3△张大宁4

目的 观察五味子醇提液（SE）对阿霉素（ADR）诱导的体外足细胞损伤中足细胞裂孔膜蛋白nephrin和骨架蛋白desmin表达的影响，并探讨其作用机制。方法体外ADR作用于足细胞24 h，造成足细胞损伤后，加入含SE的培养基，继培养24 h。设对照组（0 mg/L ADR）、模型组（0.25 mg/L ADR）、SE干预组（250 mg/L SE+0.25 mg/L ADR）、SE组（250 mg/L SE）。免疫荧光法测定各组nephrin的表达；Western Blot检测各组nephrin和desmin蛋白表达；RT-PCR检测各组nephrin和desmin mRNA表达。结果免疫荧光结果显示对照组和SE组nephrin呈颗粒状或线性分布于细胞膜，模型组较对照组、SE组和SE干预组表达强度明显减少。模型组nephrin蛋白和mRNA表达较对照组显著减少，SE干预组nephrin蛋白和mRNA表达水平较模型组增加。模型组desmin蛋白和mRNA表达较对照组显著增加，SE干预组desmin蛋白和mRNA表达水平较模型组显著减少（均P＜0.05）。SE和SE干预组的nephrin和desmin蛋白和mRNA表达水平与对照组差异无统计学意义。结论250 mg/L SE对体外培养足细胞无损伤作用，且SE能拮抗ADR对足细胞的损伤，这可能与SE可以上调nephrin和下调desmin的表达有关。

五味子科；足细胞；膜蛋白质类；阿霉素；nephrin；desmin

肾小球足细胞是一种高度分化的细胞，在体内足细胞伸出足突包绕在基底膜上，形成的裂孔隔膜在肾小球滤过屏障中起重要作用；细胞骨架对维持足细胞的正常形态有重要的作用。因此足细胞损伤是肾脏疾病进行性病变的基本特征[1]。五味子作为传统中药，有敛肺滋肾的作用，大剂量的五味子可使肾脏病变程度明显改善，减少尿蛋白、改善肾脏功能及免疫学指标。本研究借助小鼠足细胞系，通过采用体外阿霉素（ADR）导致足细胞损伤，观察五味子醇提液（SE）对足细胞中裂孔膜蛋白nephrin和骨架蛋白desmin表达的影响，探讨SE对足细胞损伤的干预保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 ADR为美国Sigma公司出品，用灭菌生理盐水配制成5 g/L的储存液，储存于-20℃冰箱，实验前应用时，用新鲜培养基稀释成所需浓度。五味子由天津市药物研究院制备。

1.1.2 试剂 RPMI-1640（美国Corning）培养液中，含10%特级胎牛血清（美国Gibco），青、链霉素各100 U/mL（美国Gibco），重组小鼠γ干扰素（IFN-γ）10 U/mL购自R＆D公司。Trizol试剂盒及电泳琼脂糖均购自日本Takara公司。所用抗体均由美国Santa Cruz公司生产。引物由生工生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 SE的制备 将五味子300 g用95%乙醇加热回流3 h，提取2次，合并提取液，静置过滤，减压回收乙醇浓缩成浸膏，-20℃保存[2]。

1.2.2 足细胞培养 小鼠足细胞系MPC5由南开大学医学院杨卓教授惠赠。培养方法参照文献[3]：足细胞于33℃在重组小鼠IFN-γ诱导下增殖；继而接种到涂有10 mg/LⅠ型胶原的25 cm2培养瓶中，置于37℃不含IFN-γ的培养基中培养10～14 d，足细胞停止增殖，获得分化表型，达80%左右融合时进行下一步实验。

1.2.3 实验分组及刺激 ADR以0.25 mg/L加入培养的足细胞，作用24 h，造成足细胞明显损伤后，再加入含有250 mg/L SE的培养基，继续培养24 h。分为对照组（0 mg/L ADR）、模型组（0.25 mg/L ADR）、SE干预组（250 mg/L SE+0.25 mg/L ADR）、SE组（250 mg/L SE）。

1.2.4 免疫荧光染色 用间接免疫荧光法检测各组细胞nephrin的表达。弃去各组细胞培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，4%多聚甲醛室温固定20 min；继而0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton-X100）处理5 min。PBS液清洗后用3%胎牛血清蛋白（BSA）室温封闭1 h，一抗孵育4℃过夜。PBS清洗5 min×3次，然后加入荧光素标记的二抗，避光室温孵育1 h。PBS清洗5 min，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核，PBS洗5 min×3次。最后用水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察nephrin表达。

1.2.5 Western Blot检测检测nephrin和desmin蛋白表达 接种于6孔板中的各组细胞以预冷PBS液洗2次，加入50 μL预冷蛋白裂解液，冰上裂解30 min，细胞刮刀收集样本。2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（BCA）法蛋白定量、配样，100℃、10 min变性后上样。经10%聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h。用等渗盐溶液加Tris-HCL缓冲液（TBST）冲洗后加nephrin、desmin及β-actin的一抗，4℃孵育过夜。TBST液冲洗，加标记辣根过氧化物酶的二抗孵育。洗膜后ECL显色，X线片曝光，冲洗，扫描。以β-actin为内参，检测nephrin和desmin蛋白的表达。

1.2.6 RT-PCR检测nephrin和desmin mRNA的表达 采用Trizol试剂盒从接种到6孔板中的各组细胞提取总RNA。紫外分光光度仪检测mRNA的含量和纯度。用逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA，然后在琼脂凝胶中电泳，凝胶成像系统成像后以GAPDH为内参，用Image J数码图像分析软件进行分析，以扩增片段与GAPDH`的灰度比值进行半定量分析。nephrin引物上游5′-TCCTGCTGCGATGGTGGTTG-3′,下游5′-GTCTGGGTTGCCTCCGATGG-3′，扩增片段311 bp；desmin引物上游5′-GCTTCGCCAACTACTTCGAG-3′，下游5′-GTGAGGTCTGGCTTGGACAT-3′，扩增片段441 bp；GAPDH引物上游5′-AAGAACAGGCTCTTAGCA-3′，下游5′-CCAGTAGACTCCACGACAT-3′，扩增产物片段134 bp。逆转录采用两步反转法：70℃10 min，冰上2 min；加入Rnase及MMLV后42℃1 h，70℃10 min，置于冰上。反应条件：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸5 min。

1.3 统计学方法 用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫荧光结果 对照组与SE组足细胞nephrin以颗粒状或线性分布于细胞膜，并有聚集中心团块在核周分布，呈连续性表达；模型组表达量明显减弱，部分区域未见表达或缺失；SE干预组较模型组表达量增强，见图1。

2.2 Western Blot结果 模型组nephrin表达低于对照组、SE干预组和SE组，模型组desmin表达高于对照组、SE干预组和SE组（均P＜0.05）；对照组和SE组、对照组和SE干预组中nephrin和desmin蛋白表达水平差异均无统计学意义，见图2、表1。

2.3 RT-PCR结果 模型组nephrin mRNA表达水平低于对照组、SE干预组和SE组，模型组desmin mRNA表达水平高于对照组、SE干预组和SE组（P＜0.05）；对照组和SE组、对照组和SE干预组中nephrin和desmin mRNA表达水平差异均无统计学意义，见图3、表2。

Figure 1 Expression of nephrin in four groups（immunofluorescence×200）图1 4组nephrin表达情况（免疫荧光×200）

Figure 2 Expression of nephrin and desmin in 4 groups图2 4组nephrin和desmin蛋白表达

Table 1 Comparison nephrin and desmin expression between 4 groups表1 4组nephrin和desmin蛋白表达水平比较（n=6，±s）

Table 1 Comparison nephrin and desmin expression between 4 groups表1 4组nephrin和desmin蛋白表达水平比较（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a与（2）组比较，P＜0.05

组别对照组（1）模型组（2）SE干预组（3）SE组（4）F nephrin/β-actin 0.964±0.030a0.525±0.128 0.896±0.029a0.978±0.021a59.021＊＊desmin/β-actin 0.818±0.113a1.244±0.116 0.853±0.118a0.828±0.046a21.422＊＊

Figure 3 Renal mRNA expression of nephrin in 4 groups图3 4组nephrin mRNA表达

Table 2 Comparison of nephrin and desmin transcription between 4 groups表2 4组nephrin和desmin mRNA表达水平比较（n=6s）

Table 2 Comparison of nephrin and desmin transcription between 4 groups表2 4组nephrin和desmin mRNA表达水平比较（n=6s）

＊＊P＜0.01；a与（2）组比较，P＜0.05

组别对照组（1）模型组（2）SE干预组（3）SE组（4）F nephrin/GAPDH 0.540±0.050a0.358±0.111 0.478±0.025a0.585±0.043a13.539＊＊desmin/GADPH 0.276±0.061a0.437±0.078 0.323±0.080a0.270±0.083a6.301＊＊

3 讨论

3.1 nephrin在肾小球足细胞中的表达及意义 足细胞是肾脏固有细胞，有支持血管球参与基底膜合成、调控肾小球选择通透性的作用。裂孔膜上某些蛋白表达或分布异常可致足突融合、足细胞损伤和脱落[4]。nephrin是裂孔膜上发现的第一种似黏附分子的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，是公认的足细胞损伤相关分子，在多种肾脏疾病中异常表达。研究证实nephrin的表达减少与蛋白尿的发生有关，nephrin表达的改变是足细胞损伤的重要标志[5]。局灶性节段性肾小球硬化症（FSGS）患者表达最低，在足突融合区nephrin几乎不表达。本课题组前期研究显示，阿霉素肾病小鼠模型中nephrin表达下降，随着病情进展，足细胞损伤持续加重，逐渐从肾小球基底膜上分离脱落，肾小球滤过屏障完整性遭到破坏，从而形成大量蛋白尿[6]。本实验采用体外ADR诱导足细胞损伤模型，也证实了足细胞损伤后，nephrin的表达减少，与前期动物实验结论一致。

3.2 desmin在肾小球足细胞中的表达及意义 desmin是足细胞骨架中间丝蛋白的一员，正常情况下，足细胞中较少表达，当各种原因导致足细胞损伤时，可大量表达。Henderson等[7]研究发现，在大鼠各种类型的足细胞损伤肾病模型中，肾小球desmin的表达显著增高，认为desmin是足细胞损伤的标志性蛋白之一。足细胞损伤时desmin表达增加可能与足细胞肥大有关，desmin表达上调可以增加细胞对抗机械张力的能力[8]。本实验通过ADR对体外培养足细胞的损伤发现，desmin蛋白水平和mRNA水平增加是足细胞损伤的敏感指标。

3.3 五味子在肾脏疾病中的应用 五味子，五味具备，具有收敛固涩，补肾宁心之效，是一种开发前景广阔的药食兼用的传统中药。现代药理研究表明，五味子有抗炎、抗氧化、清除氧自由基的作用[9]。其提取物的保护作用已经被证实用于各种器官如肝脏、心脏、肾脏的损伤[10]。动物实验证实，以五味子为君药的中药组方能有效减少糖尿病肾病和局灶性节段性肾小球硬化等模型的蛋白尿，减轻肾脏病变程度[11-12]。五味子提取物在干预大鼠肾的缺血再灌注模型中，可使血尿素氮、肌酐水平下降，提示五味子能清除氧自由基，抑制过氧化物产生，使肾组织细胞超微结构及功能免遭破坏，对肾缺血再灌注损伤有保护作用[13]。本研究显示，SE可以拮抗ADR对足细胞造成的损伤，通过比较免疫荧光、Western Blot和RT-PCR结果发现SE干预组足细胞nephrin的表达较模型组增多，desmin的表达减少；其保护足细胞的具体机制尚未十分清楚，可能与SE通过上调nephrin和下调desmin的表达从而保护足细胞的完整性，进而保护肾脏功能有关。

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（2014-02-07收稿 2014-03-06修回）

（本文编辑 李鹏）

Effects of Schisandra Chinensis Fruit Ethanol Extract on Nephrin and Desmin Expression in Adriamycin Induced Podocyte Injury

AI Chen1，TAN Xiaoyue2，ZHANG Mianzhi3，ZHANG Daning4
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Medical School of Nankai University;3 Tianjin Police Hospital; 4 Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective To explore the effect of schisandra chinensis fruit ethanol extract on nephrin and desmin expression in adriamycin(ADR)induced podocyte injury in vitro.MethodsConditionally immortalized mouse podocytes were treated with ADR for 24 h in vitro,then the medium was changed to medium with SE（250 mg/L）for 24 h.Podocytes were divided into four groups:control group，model group,SE intervention group and SE group.The expression of nephrin in podocytes was detected by immunofluorescence.Western Blot was employed to assess nephrin and desmin expression.Transcription level of nephrin and desmin were determined by qRT-PCR.ResultsNephrin expression was distributed along the cell membrane in linear or granular pattern in control group and SE group.Fluorescence intensity in model group was lower than that of control group SE group and SE intervention group.There was no significant difference of nephrin and desmin protein and mRNA level between control group and SE group.Compared with the model group,protein and mRNA level of nephrin was lower than that of control group and SE intervention group.The protein expression and mRNA transcription of desmin in model group was higher than those in control group and SE intervention group(P＜0.05).ConclusionSE（250 mg/L）has no harmful effect on the podocytes in vitro.SE can protect the podocytes from damage by adriamycin in vitro.SE not only upregulate the expression of nephrin,but also down-regulate of desmin expression.

schisandraceae；podocytes；membrane proteins；adriamycin；nephrin；desmin

R692

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.004

*国家自然科学基金资助项目（项目编号：MSFC881150012）

1天津医科大学（邮编300070）；2南开大学医学院；3天津市公安医院；4天津市中医药研究院

△通讯作者 E-mail：zhangmianzhi@vip.sina.com