正常和癌变胃粘膜组织的共焦拉曼光谱初探＊

陈 瑶，代剑华，张 华，周学谦，刘云杰，彭贵勇*

(1.第三军医大学西南医院全军消化病研究所，重庆 400038;2.中国科学院重庆绿色智能技术研究院跨尺度制造技术重点实验室，重庆 400714)

0 引言

胃癌是人类最常见的癌症之一，在癌症相关死亡率中位居第二。而胃癌的早期发现和预后密切相关。早期胃癌的5年存活率大于90%，而一旦有深层胃壁浸润或有局部淋巴结累及，5年生存率降至20-30%［1-3〛。因此早期发现在提高胃癌的存活率中具有重大意义。

胃癌的检测主要依靠影像学及内窥镜，诊断的金标准则是病理活检。我们已知，影像学检测大多都是在组织形态发生异常改变后才可以探测到，PET-CT(正电子发射计算机断层显像)虽然可以检测组织细胞的代谢改变，但分辨率也只有4-7 mm，且假阳性较高，费用昂贵。内窥镜下活检部位的选择依靠内镜医师的主观判断，且活检有出血、转移的风险。拉曼光谱可以对生物样品进行实时、快速检测，不受水的干扰，适用于体内活体诊断。不但对结构改变敏感，可以反映物质内部分子生化改变，且光谱图简单，谱峰锐利，利于分析。之前对乳腺癌、皮肤癌、喉癌等组织的拉曼光谱相关研究显示，正常和癌变组织的拉曼光谱存在明显差别［4-7〛。本研究对正常和癌变粘膜组织的拉曼光谱进行分析研究，为拉曼光谱用于临床检测研究奠定基础。

1 实验材料和方法

1.1 拉曼光谱设备

激光共聚焦显微拉曼光谱仪(RENISHAW):二极管激光器，激发波长785 nm，分辨率1-2 cm-1，最大激发光功率约300 mW，最大波谱范围100-3200 cm cm-1，光栅:1200、1800、2400，并配置有高性能 Leica显微镜，XYZ三维样品台等。

1.2 标本收集

图1 激光共聚焦显微拉曼光谱仪(RENISHAW)Fig.1 Laser confocal microscope raman spectrometer

标本均来自2012-2013年于西南医院行胃镜检查的患者。检查前均取得患者知情同意并签署相关知情同意书。本研究已通过伦理委员会的审查。共收集19例正常胃粘膜组织和12例胃癌粘膜组织。包括17男14女、平均年龄55.55±14.73岁，标本采集后立即置入1.8 mL冻存管封装后置入冰块中保存，带至拉曼光谱实验室检测(标本检测时离体时间约1 h)。各标本均经病理确诊。

1.3 拉曼光谱测定

显微共焦拉曼光谱仪参数设置:曝光时间20 s，累积次数2次，激发光功率30 mW，光栅1200，波普采集范围800-1800 cm-1。测量前用硅片校准仪器。仪器校准后，将标本从冻存管中取出，平铺于载玻片上，对每例标本随机选取1个点进行采集，共获得31个拉曼光谱图(包括12个胃癌和19例正常)。激光共焦显微拉曼光谱仪如图1。

1.4 根据拉曼光谱原理及参考文献总结人体组织拉曼光谱谱峰归属

当入射光与样品分子发生能量交换(非弹性碰撞)则会产生频率发生改变的散射光，即拉曼散射。入射光的频率(v0)与散射光的频率(vib)之差即拉曼位移(△v，△v=v0-vib)。对于同一物质，拉曼位移只和样品分子的振动有关，与入射光的频率无关(拉曼位移即波数=1 cm/v0-vib)［8］。拉曼位移频率等于分子官能团的振动频率。组成分子的各种官能团如 C=O、C-N、C=C、C-H、苯环等都有其各自特定的拉曼位移峰，分子其他部分对该峰的位置影响很小，这种有特定峰形或较高强度的峰，代表某种特定官能团存在，称作官能团特征振动峰，峰所在的位置称特征振动波数。参考文献［9-18］，总结人体组织拉曼光谱谱峰归属。

1.5 数据处理及分析

所获原始光谱数据均予以强度标准化、减掉基线背景等处理。并采用 spss、excell、NGS-Labspec等软件分析处理。寻找胃正常和癌变粘膜组织的拉曼特征峰，计算特征峰平均位移、相对峰强比等。比较分析相对峰强，结合两独立样本t检验，绘制ROC曲线等。

2 实验结果

2.1 人体组织拉曼光谱谱峰归属

具体归属见表1。

表1 人体组织的拉曼光谱谱峰归属Tab.1 Raman peaks assignment of human tissues

2.2 正常和癌变胃粘膜组织的拉曼特征峰分析

本次研究所测得正常和癌变胃粘膜组织的全部光谱分别如图2和3所示，平均光谱如图4和5所示。由平均光谱分析可见，癌变胃粘膜的拉曼光谱发生了明显改变。正常和癌组织中853 cm-1、939 cm-1、1004 cm-1、1128 cm-1处谱峰位置固定，表明测量前仪器校正准确，癌变组织的拉曼特征峰位移有意义。检测所获具体特征峰分布如下表2所示。由表可以看出，拉曼特征峰主要分布于800-1300 cm-1之间。除 1660 cm-1、1241 cm-1、1207 cm-1、1156 cm-1之外，正常胃粘膜组织特征峰相对强度大于胃癌。和正常相比，癌变胃粘膜中特征峰平均位移2.57 ±1.28 cm-1。除 829 cm-1、1800 cm-1发生了蓝移(向低波数移动)之外，癌组织特征峰主要发生了红移(与蓝移相反)。而我们已知红移主要是基团的活化、扭曲、吸附等，导致振动的能量减少;而蓝移则表示振动的能量增加，可能是引入了新的基团或化学键，或是由于周边的基团的活化，是其振动更加稳定。与正常组织相比，胃癌增加了特征峰1263 cm-1、1586 cm-1，同时减少了特征峰 956 cm-1、1172 cm-1。我们已知，这几个特征峰均表征蛋白质，提示癌组织内部蛋白质组成发生了改变。

2.3 相对峰强比区分正常和癌变胃粘膜组织

所有光谱的I1087cm-1/I1207cm-1如下表3所示。采用两独立样本的t检验，分析发现胃癌和正常胃粘膜相对强度比I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌和正常胃粘膜组织中存在明显差别(P＜0.05)，胃癌中 I1087cm-1/I1207cm-1≥1.87(平均值 1.05 ± 0.30)，而胃正常粘膜组织中 I1087cm-1/I1207cm-1＜1.87(平均值 0.39±0.09)。I1087cm-1/I1207cm-1区分胃癌和正常胃粘膜组织的准确率、灵敏度和特异度分别为87.1%、83.3%、89.5%，如图6ROC曲线所示。

图2 胃癌的拉曼光谱(n=12)Fig.2 Raman spectrums of gastric cancer(n=12)

图3 胃正常粘膜组织的拉曼光谱(n=19)Fig.3 Raman spectrums of gastric normal tissues(n=19)

图4 胃癌和胃正常粘膜组织的平均拉曼光谱Fig.4 Average Raman spectrum of malignant and normal gastric tissues

表2 正常和癌变胃粘膜的拉曼特征峰Tab.2 Characteristic raman peaks of normal and malignant gastric tissues

图5 拉曼光谱(胃正常-胃癌，平均)Fig.5 Raman spectrum(gastric normal-cancer，average)

3 讨论

胃癌的发生伴随一系列生理生化代谢改变，如DNA解聚并大量复制、相关酶的合成等，其组分如蛋白质、脂质、核酸等大分子比例组成、内部化学键及分子之间官能团相互作用也随之改变，从而引起拉曼光谱呈现出相应特征性改变。不仅可以通过癌变特征光谱区分正常和癌变，而且可以探索发现癌变的分子起源。目前胃粘膜癌变的拉曼光谱检测分析逐渐引起研究者们的关注。代剑华等［19］提取正常胃粘膜、肠化胃粘膜、胃腺癌细胞基因组DNA进行拉曼光谱分析，推测三种细胞DNA的磷酸骨架链由稳定、不稳定发展到断裂。Z Huang等［20］研究发现正常胃粘膜和异型增生胃粘膜的拉曼光谱有特征性差别，如特征峰1450 cm-1及1305 cm-1的相对峰强在异型增生的胃粘膜中明显增加，I875cm-1/I1450cm-1作为诊断法则，鉴别异型增生和正常组织的灵敏度及特异度分别达到85.7%和80.0%。而我们已知胃粘膜癌变大都由异型增生发展而来。因此，我们对正常和癌变胃粘膜的拉曼光谱进行了初步分析研究。

表3 相对峰强比(I1087 cm-1/I1207 cm-1)Tab.3 Ratio of relative peak intensity(I1087 cm-1/I1207 cm-1)

图6 ROC曲线来自于两独立样本的t检验，曲线下面积为0.908，充分说明了I1087/I1207鉴别胃正常和癌变粘膜组织的有效性Fig.6 The receiver operating characteristic(ROC)curve generated from the two independent T-test，the integration area under curve(AUC)is 0.908，inllustrating the efficacy of I1087 cm-1/I1207 cm-1in differentiating malignant from normal gastric tissues

由此次研究中正常和癌变胃粘膜的拉曼光谱对比分析可以发现，在相同检测条件下，胃癌的总体拉曼峰强度小于正常胃粘膜组织。我们已知胃癌组织血供丰富，而红细胞富含卟啉，卟啉为强荧光物质，可能因此掩盖了部分拉曼信号。

与正常胃粘膜组织相比，胃粘膜癌变后特征峰主要向高波数移动，即发生了红移，振动能量降低。可能癌组织中分子内部化学键、官能团等有更多的振动模式，一致性降低，振动能量降低。提示组织细胞癌变中，不仅宏观形态如组织形态、细胞排列、细胞核结构等发生了异常，其微观组成如分子内部化学键、基团之间的相互作用等也发生了相应改变。进一步证实了拉曼光谱可以在分子生化水平跟踪监测癌变。

特征峰1263 cm-1、1586 cm-1仅在胃癌组织中出现，而正常组织中不明显。已知1263 cm-1来自于N-H的弯曲振动和C-H的伸缩振动［21］，表明某种蛋白质的构型构象发生了改变，导致某些氨基酸侧链的暴露活化，出现了新的振动频移位点;也可能是由于癌组织细胞活跃的增殖过程中合成了某种新的蛋白质。相反，特征峰1172 cm-1、955 cm-1仅在正常胃组织中出现，而在胃癌中这两个特征峰不明显。已知1172 cm-1主要是来自芳香族氨基酸的C-H面内弯曲振动［15］，提示胃癌组织中芳香族氨基酸与邻近分子相互作用增强;也可能是胃癌组织中芳香族氨基酸含量减少。我们已知组织细胞内部蛋白质的含量及种类非常丰富，我们的研究结果提示癌组织中蛋白质的组成比例、种类、构型等发生了改变。表明拉曼光谱在探索分析癌变组织细胞内部如蛋白质、DNA等大分子物质的相对含量、结构特征、存在状态中具有独特的优势。

由表3可见，与正常胃粘膜组织相比，I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌中明显大于正常组织。而我们已知，1087 cm-1表征核酸，1207 cm-1表征蛋白质，提示相对于蛋白质，核酸相对含量增加更明显。反映了癌细胞有丝分裂活跃，核酸的含量明显增加。在随后深入的研究中，我们会增加样本量，进一步证实这个结论。

本研究通过对比分析胃正常和癌变粘膜组织的拉曼光谱差异，结合统计学分析，区分胃正常和癌变粘膜组织，并初步探索癌变相关的分子生化改变，主要结果如下:1.和正常相比，胃癌组织的拉曼特征峰主要向高波数发生位移，提示胃癌组织内部分子化学键或官能团的振动模式多样化。2.特征峰1263 cm-1和1586 cm-1仅在胃癌中出现，正常组织中不明显;与此相反，955 cm-1仅在正常组织中出现，而胃癌中不明显。提示胃癌组织内部大分子物质如蛋白质等的相对含量、构型构象、存在状态等发生了改变。3.相对峰强比I1087cm-1/I1207cm-1在胃癌和正常胃粘膜组织中存在明显差别(P＜0.05)，胃癌中 I1087cm-1/I1207cm-1≥1.87，其鉴别胃癌和正常胃粘膜组织的准确率、灵敏度和特异度分别高达87.1%、83.3%、89.5% 。

因此，拉曼光谱检测胃癌和正常胃粘膜组织，不仅可通过相对峰强比等鉴别癌变，还可通过光谱探索癌变组织细胞内部的分子生化改变。提示拉曼光谱在胃癌的跟踪监测、临床诊断和基础研究中具有良好应用前景。

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