子宫内膜异位症患者病变组织中miRNA-21、PTEN蛋白的表达变化及意义

何宏月，朱颖军，王 芳，林婉君

(1天津医科大学研究生院，天津300070;2天津市中心妇产科医院)

子宫内膜异位症(Ems)是具有生长功能的子宫内膜组织在子宫腔之外的部位浸润生长所导致的疾病，其影响着6% ～10%的育龄期妇女，多种因素可促使EMs的发生［1］。miRNA是一类高度保守的单链非编码小分子RNA，其参与转录后水平的基因调节，miRNA与靶 mRNA的3'端的非编码片段(3'UTR)配对，阻止该基因的翻译过程或者促使其降解，从而调节基因的表达［2］。PTEN在 PI3K/Akt/PKB/cyclinD、FAK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR/STAT3等通路中有重要抑制作用，能促凋亡、抗增殖，而其缺失或突变则导致肿瘤的发生。文献［3］发现，Ems中PTEN的表达降低。本研究观察了Ems组织中微小RNA-21(miRNA-21)、PTEN蛋白的表达变化，并探讨两者在Ems发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2012年12月～2013年12月天津市中心妇产科医院诊断为Ems并接受腹腔镜手术治疗的Ems患者30例(观察组)，年龄(42±3.4)岁。全部病例均经术后病理证实。患者月经规律，无其他外科、内分泌、免疫及代谢性疾病，术前6个月内未接受GnRH类似物、激素类药物及抗生素治疗，无围绝经期症状。术前行刮宫术收集在位内膜，术中取材卵巢的异位子宫内膜。另选同期因宫颈原位癌行子宫切除术的患者30例作为对照组，年龄(41±4.3)岁。术后无菌条件下刮取子宫内膜。两组留取标本均经医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。所取组织置于Enpendorf管中，放入液氮罐，保存用于提取蛋白和RNA。

1.2 试剂与仪器 兔抗人PTEN单克隆抗体;鼠抗人GAPDH单克隆抗体;HRP标记羊抗兔抗体、HRP标记羊抗小鼠IgG二抗;mirVana TM miRNA Isolation Kit;RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit;Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit;DYY-7C型电泳仪;DU640紫外分光光度计;Biometra PCR扩增仪;ABI Prism®7500型RT-PCR仪;电泳槽、玻璃板、海绵及样品梳;引物由Primer 5软件设计，具体引物序列:miRNA-21:GGACTAGCTTATCAGACTG，CATCAGATGCGTTGCGTA;U6snRNA:ATTGGAACGATACAGAGAAGAT，GGAACGCTTCACGAATTT。

1.3 miRNA-21和PTEN蛋白的检测 ①miRNA-21:采用 RT-PCR法。用 TRIzol法提取组织中总RNA，用分光光度计测定OD值及RNA浓度，将提取的1 μL RNA加到20 μL体系中进行逆转录反应合成cDNA，之后在RT PCR仪器中进行qPCR实验:95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，62 ℃、40 ～60 s，循环40次，行3次平行实验。采用相对定量的方法，以U6的表达为内对照，依据公式ΔCt=Ct目的基因－Ct内参基因，分别计算观察组和对照组的ΔCt，目的基因的相对表达量为2－ΔΔCt，记录3次实验的相对表达量，取其平均值。②PTEN蛋白:采用Western blotting法。提取组织中蛋白，等质量上样电泳，经过转膜、封闭、一抗及二抗孵育，最后加入显影液，进行图像分析。用Quantity One软件进行灰度分析，将目的条带与GAPDH的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量，记录3次实验结果，取其平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，结果比较用t检验及单因素方差分析;Pearson直线相关性检验分析观察组miRNA-21、PTEN蛋白的相关性。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组miRNA-21、PTEN蛋白表达比较 结果见表1。

表1 两组miRNA-21、PTEN蛋白表达比较(±s)

表1 两组miRNA-21、PTEN蛋白表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01;与同组在位内膜比较，﹟ P＜0.01

组别 n miRNA-21 PTEN 蛋白观察组30 0.068 9±0.010 7 1.946 1±0.101 9 30异位内膜 0.416 8±0.052 7△﹟ 1.151 4±0.046 5△﹟在位内膜 0.241 4±0.033 3* 1.497 8±0.037 2△对照组

2.2 观察组miRNA-21、PTEN蛋白表达的关系Pearson直线相关性检验分析显示，观察组miRNA-21表达与PTEN蛋白表达呈负相关(r=－0.464，P＜0.01)。

3 讨论

Ems是一种具有一定恶性行为的妇科良性疾病，异位子宫内膜细胞的迁移、黏附、浸润性生长及血管生成是其发生的病理基础。近年来，转录后调控基因表达已经成为增殖性病变分子研究的热点，作为自然形成的转录后调节因子，miRNAs通过调节基因表达的稳定性，在多种生命活动中发挥着重要作用，包括细胞生成、分化、凋亡、炎症及免疫反应等，可能成为发病机制的关键因素［4］。

miRNAs通过抑制其靶mRNAs的表达或促进靶mRNAs的降解调控基因表达，导致一系列疾病的发生。miRNA的异常表达与许多人类的肿瘤发生、发展有关，其中miRNA-21位于17q23.1，在人类肿瘤中起重要作用，在肿瘤中表达升高，并促进肿瘤细胞的生长及增殖能力，包括宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫肌瘤、EMs相关的卵巢癌［5～11］。本研究显示，观察组在位内膜、异位内膜中miRNA-21表达均高于对照组，这与上述在其他疾病中研究结果一致。Meng等［12］在人肝癌细胞中的研究发现，miRNA-21可以通过调节PTEN表达起到促进癌细胞增殖、迁移、浸润的作用，PTEN是miRNA-21的直接作用靶点，PTEN mRNA的3'UTR区存在miRNA-21的直接结合位点，miRNA-21通过与之结合，在转录后水平调节PTEN的表达，参与多种疾病的发生、发展［12～14］。研究表明，miRNAs通过调节其广泛的靶基因改变子宫内膜的生理及生物学特性，miRNA在异位内膜和正常内膜间的表达有差异，这些差异表达的miRNA可能与Ems的发生、发展有关［15］。但其作用的精细过程并不清楚，因此获取更多的miRNA信息对于研究是必须的。现在的研究集中于三个方向:①在全基因组水平建立miRNA表达谱与编码基因表达谱及其蛋白之间的联系，揭示Ems发生的分子机理;②明确 Ems中miRNA的差异表达的构成及其生物特性变化;③发展有效的技术来精密地调节miRNA的表达，最终建立起新的治疗方法。

抑癌基因PTEN又名MMAC1或TEP1，1997年分别由 Li等［16］、Li等［17］和 Steck 等［18］3 个研究小组发现，PTEN基因定位于10号染色体q23.31区，全长200 kb，包含9个外显子和8个内含子，开放阅读框由1 209个核苷酸组成，并编码由403个氨基酸组成的蛋白。在Ems基因小鼠模型中，从Ems进展为子宫内膜样癌依赖于克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因激活和第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物肿瘤抑制基因的失活［19］。PTEN蛋白同时具有脂质和蛋白双特异磷酸酶活性，是迄今为止发现的第一个具有脂质磷酸酶活性的抑癌基因［20］。PTEN蛋白的脂质磷酸酶活性可使细胞周期停滞在G1/S期，还可以通过影响PI3K活性而控制Akt磷酸化水平，并激活Akt下游信号蛋白成员，作用于细胞生理的多个方面，包括调节细胞的黏附、转移及分化等，从而促进细胞增生、血管形成、抑制凋亡［21］。本研究显示，观察组 PTEN蛋白表达降低，提示PTEN蛋白可导致异位内膜异常的增殖、黏附、迁移等，与Ems的发生密切相关。本研究还发现，观察组miRNA-21表达与PTEN基因表达呈负相关，我们推测在Ems组织中高表达的miRNA-21可能通过抑制PTEN表达，调控子宫内膜细胞的生物学行为，促进子宫内膜在子宫腔以外的增殖、黏附、转移及血管形成等，参与Ems的分子发病机制，但其具体调控功能尚需进一步研究。

随着对于miRNA作用机制的进一步深入研究，miRNA很可能会成为疾病诊断的新生物学标志物，或是作为药物作用的靶点进行新药研发，为Ems治疗提供新的手段。

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