经皮穴位电刺激对高龄妇女卵细胞质量及Bcl-2、Bax的影响

连方,刘菲,帅振虹



经皮穴位电刺激对高龄妇女卵细胞质量及Bcl-2、Bax的影响

连方1,刘菲2,帅振虹2

(1.山东中医药大学附属医院,济南 250011;2.山东中医药大学,济南 250014)

观察经皮穴位电刺激对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期肾虚高龄妇女卵颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达及卵细胞质量的影响。将66例因输卵管因素行IVF-ET的肾虚高龄妇女随机分为治疗组(经皮穴位电刺激治疗)和对照组(伪针),每组33例。观察两组患者肾虚证候积分变化,HCG日单个卵雌激素(E2/卵泡数)、优卵率、优胚率、临床妊娠率的差异,并应用蛋白印迹法(Western blot)检测卵颗粒细胞Bcl-2、Bax蛋白表达。与对照组相比,治疗组患者肾虚症状明显改善(＜0.01),HCG日E2/卵泡数、优卵率、优胚率明显升高(＜0.05),Bcl-2蛋白表达明显增多(＜0.01),Bax蛋白表达明显降低(＜0.01),获卵数和临床妊娠率无显著差异(＞0.05)。Bcl-2、Bax蛋白表达与IVF相关参数有明显相关性(＜0.05)。经皮穴位电刺激能改善高龄妇女肾虚症状,提高卵细胞及胚胎质量,此作用可能与调节颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,降低颗粒细胞凋亡有关。

经皮穴位电刺激;Bcl-2;Bax;卵细胞质量;体外受精-胚胎移植

女性生育能力随着年龄的增长逐渐下降,35岁以后妊娠机会显著减少。在助孕技术中,高龄妇女卵细胞质量下降成为制约其临床妊娠率的关键因素。颗粒细胞通过缝隙连接,以自分泌和旁分泌的方式对卵细胞起营养支持、信息传递等重要作用。Bcl-2、Bax蛋白为B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族成员,定位于线粒体膜,通过调节线粒体膜电位和线粒体膜的通透性来调控颗粒细胞凋亡,分别起抑制和促进颗粒细胞的凋亡的作用[1]。本研究观察经皮穴位电刺激对行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的肾虚型高龄不孕患者卵颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达及卵细胞质量的影响,现报道如下。

1 临床资料

1.1 研究对象

66例患者来源于2013年3月至2013年9月山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心门诊,随机分为治疗组和对照组,每组33例。两组患者年龄、病程、治疗前肾虚证候积分、治疗前基础内分泌水平比较差异均无统计学意义(＞0.05),具有可比性。详见表1-2。

表1 两组患者一般资料比较 (±s)

表2 两组患者治疗前基础内分泌水平比较 (±s)

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准

符合乐杰主编《妇产科学》[2]中不孕症诊断标准;符合中国中西医结合学会妇产科专业委员会1990年第三届学术会议修订的“女性不孕症的诊疗标准”[3]中输卵管阻塞诊断标准。

1.2.2 肾虚中医辨证标准

主证为不孕,经色淡黯,或者月经迟发,腰骶酸痛,胫膝酸软或者足跟痛,舌质淡黯,苔白,两尺脉沉细或者沉细弱;兼证为头晕耳鸣,小腹冷,夜尿多,性欲减退。以上主证必须具备,兼证具备1～2项即可以诊断。

中医症状积分标准[4],根据症状程度(症状影响日常生活;症状明显;轻度症状;正常)分别积分,主证腰骶酸痛记6、4、2、0分,其余症状记3、2、1、0分。

1.3 纳入标准

①年龄在35～45岁之间;②符合西医输卵管阻塞性不孕症诊断标准;③符合中医肾虚不孕症辨证标准;④签署知情同意书;⑤男方精液常规检查正常。

1.4 排除标准

①其他原因所致不孕症;②基础内分泌FSH＞15mIU/mL者;③近3个月内应用激素类药物者;④子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠者;⑤患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病者;⑥患有《母婴保健法》规定的不宜生育的遗传性疾病者;⑦具有吸毒等严重不良嗜好者;⑧接触致畸量的射线、毒物、药品并处于作用期者。

2 治疗方法

2.1 治疗组

采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长方案超促排卵。促性腺激素(gonadotropin,Gn)启动日至应用绒促性素(HCG)日给予经皮穴位电刺激治疗,将韩氏治疗仪的电极贴片贴于相应穴位上,关元、中极为一对正负极,双侧子宫、三阴交分别为一对正负极,强度以患者能耐受为度,持续30 min,隔日1次。常规取卵、体外受精、胚胎培养及移植。

2.2 对照组

采用GnRH-a长方案超促排卵。伪针的使用时间和穴位与治疗组相同,与患者交谈分散患者注意力,使用伪针(将长25 mm毫针剪去0.5寸,将断面打磨圆滑,穿于一橡胶片上)于相应穴位置模拟毫针刺法但不刺破表皮,仅使患者有点触感,使其认为毫针已刺入皮肤,用胶布固定橡胶片从而固定针身。常规取卵、体外受精、胚胎培养及移植。

3 治疗效果

3.1 观察指标

3.1.1 肾虚证候积分

分别计算患者入组时和HCG日肾虚证候积分。

3.1.2 IVF相关参数

HCG日E2/卵泡数、获卵数、优卵率、优胚率、临床妊娠率。卵细胞形态学(成熟度)分级标准[5],Ⅲ级卵细胞为优质卵。胚胎按WIH评分系统[6],分数≥7分为优质胚胎。胚胎移植(ET)后4～5星期做阴道B超检查,见胎囊、胎芽反射及胎心者诊断为临床妊娠。

3.1.3 颗粒细胞Bcl-2、Bax蛋白表达

实验室回收卵母细胞后,留取卵泡液,提取颗粒细胞,进一步纯化后用Western blot法测定。

3.2 统计学方法

应用SPSS17.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差表示,采用独立样本检验,计数资料采用卡方检验;双变量相关性分析采用相关分析。

3.3 治疗结果

3.3.1 两组患者肾虚证候积分比较

两组患者HCG日肾虚证候积分及治疗前后差值分别比较,差异均有统计学意义(＜0.01),治疗组在肾虚证候改善方面优于对照组。详见表3。

表3 两组患者肾虚证候积分比较 (±s,分)

注:与对照组比较1)＜0.01

3.3.2 两组临床妊娠率比较

两组患者临床妊娠率比较差异无统计学意义(＞0.05),但治疗组与对照组相比有增高趋势。详见表4。

表4 两组临床妊娠率比较 (n)

3.3.3 两组患者IVF相关参数比较

与对照组相比,治疗组HCG日E2/卵泡数、优卵率、优胚率均明显升高(＜0.01),获卵数无显著差异(＞0.05),但治疗组与对照组相比有增高趋势。详见表5。

3.3.4 两组卵颗粒细胞Bcl-2和Bax蛋白表达比较

与对照组相比,治疗组患者卵颗粒细胞Bcl-2蛋白表达显著升高(＜0.01),Bax蛋白表达显著降低(＜0.01)。详见表6、图1。

组别nE2/卵泡数(pg/mL)获卵数(个)优质卵率(%)优胚率(%)E2/卵泡数(pg/mL) 治疗组33259.77±25.451)13.58±6.55 82.85±19.421) 59.63±15.301) 259.77±25.451) 对照组33235.59±26.4412.03±6.6757.79±16.4037.72±27.63235.59±26.44

组别nBcl-2/actinBax/actin 治疗组330.67±0.161) 0.34±0.171) 对照组330.50±0.200.51±0.20

注:与对照组比较1)＜0.01

图1 治疗组(4、5)对照组(1、2、3)Bcl-2、Bax蛋白表达

3.3.5 颗粒细胞Bcl-2、Bax蛋白与IVF相关参数相关性分析

两组患者颗粒细胞Bcl-2与Bax蛋白表达呈明显负相关(=-0.980,＜0.01);Bcl-2蛋白与HCG日E2/卵泡数呈明显正相关(=0.325,＜0.01),与获卵数呈明显正相关(=0.634,＜0.01),与优卵率呈明显正相关(=0.547,＜0.01),与优胚率呈明显正相关(=0.717,＜0.01);Bax蛋白与HCG日E2/卵泡数呈明显负相关(=-0.270,＜0.05),与获卵数呈明显负相关(=-0.653,＜0.01),与优卵率呈明显负相关(=-0.493,＜0.01),与优胚率呈明显负相关(=-0.694,＜0.01)。

4 讨论

经皮穴位电刺激是对传统针刺治疗的改良,克服了针刺入皮肤时的疼痛感,无创[7],减少了长时间针刺造成的局部机械损伤,且刺激范围大,操作方便,现亦被应用于辅助生殖领域。经皮穴位电刺激可从整体上调节机体内分泌和卵巢局部微环境,提高卵巢低反应患者临床妊娠率[8],提高多囊卵巢综合征患者卵泡液白血病抑制因子,改善其卵细胞和胚胎质量[9]。

中医学认为肾虚在女性生殖机能衰老的过程中起决定作用,肾脏精气虚衰,天癸少而竭,则经水无以行,卵细胞无以生,出现卵细胞发育不良、成熟延迟、萎缩及排出障碍等,导致高龄妇女生殖功能低下[10]。高龄不孕患者主要以肾精虚衰、冲任不固为基本特征,且使用外源性激素超促排卵,使多个卵泡生长发育成熟并取出,过度耗竭肾中阴阳,更易加重肾虚症状。故以补肾益精、调理冲任为基本治法,取关元、中极为主穴,以补肾益精培元,以三阴交、子宫为配穴,以调理冲任气血。诸穴并用,以期达到补肾益精、调理冲任的目的。

本研究显示,治疗组患者肾虚症状改善程度、IVF相关参数均优于对照组,说明经皮穴位电刺激在改善高龄妇女肾虚症状、提高卵细胞及胚胎质量方面有显著效果。与对照组相比,治疗组患者卵颗粒细胞Bcl-2蛋白表达明显升高,Bax蛋白表达明显降低,且二者呈负相关,作为影响颗粒细胞凋亡的因素,Bcl-2蛋白具有抑制颗粒细胞凋亡作用,Bax蛋白具有促进颗粒细胞凋亡作用[1],说明经皮穴位电刺激可以调节颗粒细胞凋亡相关蛋白的表达,降低颗粒细胞凋亡。研究显示Bcl-2蛋白表达与IVF相关参数均呈明显正相关,Bax蛋白表达与IVF相关参数呈明显负相关,说明卵颗粒细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达与卵细胞和胚胎质量密切相关,可有效预测卵细胞、胚胎质量。综上所述,经皮穴位电刺激可以通过补肾益精、调理冲任,改善高龄妇女肾虚症状,提高卵细胞及胚胎质量,此作用机理可能与调节卵颗粒细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达,降低颗粒细胞凋亡有关。

[1] 王昭晖,张耀君,师红,等.卵泡颗粒细胞凋亡相关蛋白的研究进展[J].生命科学,2009,21(4):494-498.

[2] 乐杰.妇产科学[M].第7版,北京:人民卫生出版社,2008: 351- 355.

[3] 王曼,俞瑾,钱祖淇.子宫内膜异位症、妊娠高血压综合征及女性不孕症的中西医结合诊疗标准[J].中西医结合杂志,1991,11(6): 376-379.

[4] 国家技术监督局.中华人民共和国国家标准:中医临床诊疗术语证候部分[M].北京:中国标准出版社,1997.

[5] 卢惠霖,卢光琇.人类生殖与生殖工程[M].郑州:河南科学技术出版社,2001:109-110.

[6] Puissant F, Van Rysselberge M. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment[J]. Hum Reprod,1987,2(8): 705-708.

[7] 师小伟,刁枢.经皮穴位电刺激超前镇痛对术后芬太尼镇痛效果的影响[J].上海针灸杂志,2014,33(4):330-331.

[8] 邱文喜,张小玉.经皮穴位电刺激对卵巢低反应患者胚胎质量及妊娠结局影响的临床观察[J].中国性科学,2012,20(7): 22-24.

[9] 李彦俐.电针对IVF-ET周期的PCOS患者卵泡液LIF和卵细胞质量的临床研究[D].山东中医药大学,2011.

[10] 王瑞霞,连方,孙振高.从现代生殖医学角度探讨“肾藏精主生殖”理论[J].辽宁中医杂志,2010,53(9):1672-1674.

Effect of Transcutaneous Acupoint Electrical Stimulation on Oocyte and Bcl-2 and Bax in the Older Women

1,2,2.

1.250011,; 2.250014,

To observe the effect of transcutaneous acupoint electrical stimulation (TAES) on the ovarian granulosa cell apoptosis-related proteins, Bcl-2 and Bax, as well as the oocyte quality in the older women with kidney deficiency receiving in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET).Sixty-six older women with kidney deficiency who were receiving IVF-ET because of the fallopian tube factor were randomized into a treatment group (intervened by TAES) and a control group (intervened by sham acupuncture), 33 in each group. The kidney-deficiency syndrome score, HCG E2/follicle count per day, excellent follicle rate, excellent embryo rate, and clinical pregnancy rate were observed and compared between the two groups; Western blot was used to detect the expression of protein Bcl-2 and Bax.Compared to the control group, the treatment group had significant improvement in kidney-deficiency symptoms (＜0.01), significant increases in the HCG E/follicle count per day, excellent follicle rate, and excellent embryo rate (＜0.05), enhanced expression of Bcl-2 protein (＜0.01), and decreased expression of Bax protein (＜0.01); while there were no significant differences in comparing the retrieved oocyte number and clinical pregnancy rate (＞0.05). The expression of Bcl-2 and Bax proteins were markedly correlated with IVF-related indexes (＜0.05).TAES can improve the kidney-deficiency symptoms and the quality of oocyte and embryo in older women; this action is possibly related to the regulation of expression of the cell apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax, as well as the decrease of granulose cell apoptosis.

Transcutaneous acupoint electrical stimulation; Bcl-2; Bax; Oocyte quality; In vitro fertilization-embryo transfer

1005-0957(2014)12-1097-03

R246.3

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.12.1097

2014-03-20

连方(1957 - ),女,主任医师,博士