葛根素预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制

常明则 田 晔 乔 琳 王新来 狄政莉 刘志勤 毛 佳 吴海琴

临床上尽早促进缺血脑组织再灌注是急性脑梗死治疗的核心措施及有效手段之一，但随之可能继发脑缺血再灌注损伤严重影响其预后。脑缺血再灌注后的病理生理变化极其复杂，脑组织缺血缺氧引起的炎症性反应及氧自由基生物膜损害等是目前广泛公认的脑损伤机制［1，2］。目前，中药对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究仍备受关注，丹参提取物对脑缺血再灌注模型大鼠预处理可通过减轻氧化应激损伤而具有神经保护作用［3］。课题组在前期表明，葛根素后处理对大鼠全脑缺血再灌注损伤及慢性脑缺血损伤均具有明显脑保护作用［4，5］，本研究拟通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，应用神经行为学、测定脑组织含水量及MDA手段来探讨葛根素预处理是否具有脑保护作用及其剂量相关性？氧化应激是否参与其脑保护机制？

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 葛根素：陕西安康正大制药厂，水合氯醛：西安试剂厂，尼龙线栓：北京沙东生物技术有限公司，丙二醛（Malondialdehyde，MDA）测定试剂盒：南京建成生物工程研究所，分析天平（JA2003）：上海精科，内切式组织匀浆机：德国Heidoph公司，分光光度计UV－WFZ75：上海复日科技有限公司。

1.2 实验动物及分组 健康雄性Sprague－Dawley大鼠120只，2月龄，体质量250～300 g，清洁级，由西安交通大学医学院动物中心提供，动物合格证号0008366。实验前将大鼠置于实验室适应环境1周，自由进食、饮水，室温（22＋2）℃，相对湿度65%，每天光照12 h。采用随机数字表法分为5组：假手术组（S组），IR 组，Pc－24 h 100 mg组，Pc－24 h 200 mg组，Pc－24 h 400 mg组。

1.3 模型制备 （1）预处理：在缺血前24 h Pc－24 h 100 mg组、Pc－24 h 200 mg组及 Pc－24 h 400 mg组均分别给予葛根素100 mg·kg－1、200 mg·kg－1及400 mg·kg－1腹腔注射行单次预处理，I－R组于缺血90 min再灌注即刻给予等量生理盐水腹腔注射。（2）动物模型：依据 Zea－Longa线栓法［6］，参照课题组方法［7］；皮肤外留栓塞线头长约6 mm；缺血时间90 min拔掉线栓，制备完成局灶性脑缺血再灌损伤模型。其中S组麻醉和手术过程同模型组，分离左侧颈总动脉及颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，但不插栓线。造模后大鼠有下列情形之一者排除本研究：无神经功能缺陷；出现意识丧失；开颅发现蛛网膜下腔出血；未达观察时相点死亡。并通过随机抽样原则补齐。

1.4 神经行为学评分 取材前对实验大鼠进行神经行为学评分，依据课题组前期实验研究［7］，选取Garcia评分法［8］，Garcia18分的评价法：最高18分，最低，3分。

1.5 2，3，5－氯化三苯基四氮唑法测定脑梗死体积百分比 术后24 h每组取8只大鼠，给予10%水合氯醛（0.50 ml／100 mg）腹腔注射，断头取脑，冰水冲洗；将脑组织标本置于－20℃中20 min后取出，自前向后均匀冠状切片，约每隔1.8 mm，共切6片；放置于1%2，3，5－氯化三苯基四氮唑法（2，3，5－triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸缓冲液中，37.5℃避光下共孵育30 min；正常组织染成红色，脑梗死组织为白色；脑切片经数码摄像后将图像数据输入计算机，用Image－pro plus 5.1软件（美国Media Cybernetics公司）作图像分析；将Image计算出的每一脑切片坏死区域面积乘以切片的厚度（1.8 mm），计算出脑梗死容积，累计每只大鼠所有脑切片的脑梗死容积即得全脑梗死容积，并计算脑梗死体积百分比（brain infarct volume percentage，BIVP）。

1.6 脑组织含水量测定 再灌注24 h时每组取8只大鼠，断头取缺血侧大脑半球，电子天平称其湿重后置于110℃恒温箱烧烤24 h至恒重，称其干重，计算脑组织含水量＝（湿重－干重）÷湿重×100%。

1.7 MDA活性水平测定 再灌注24 h时每组随机取8只大鼠，断头取缺血侧额叶组织20 mg，用冰生理盐水制成1%溶浆，4℃4000 r／min离心15 min，离心半径约9.5 cm，取上清液按照MDA测定试剂盒说明书实验步骤分别测定左侧额叶MDA水平。MDA水平测定用硫代巴比妥酸（TBA）法，于532 nm处用分光光度计测吸光度。

1.8 统计学处理 采用SPSS 18.0软件包，所有数据以均数±标准差（±s）表示，均进行正态检验和方差齐性检验，组间比较采用单因方差分析，SNK－q检验做两两比较，并应用Correlate进行相关性分析。取P＜0.05为差显著性标准。

2 结 果

2.1 神经功能评分、BIVP、脑组织含水量及 MDA水平 与S组比较，IR组和PC－24 h组神经功能评分显著下降，BIVP、脑组织含水量及MDA显著升高（P 均＜0.01）；与IR组比较，PC－24 h组神经功能评分显著改善，BIVP、脑组织含水量及 MDA显著降低（P均＜0.01）；在3组不同剂量预处理组中Pc－24 h400mg组神经功能评分显著改善，BIVP、脑组织含水量及 MDA显著降低（P均＜0.01），其中神经功能评分、BIVP及脑组织含水量在Pc－24 h 100 mg组及Pc－24 h 200 mg组中无显著差异（P均＞0.05）（表1、表2及图1）。

表1 各组大鼠神经功能评分和BIVP（±s）

表1 各组大鼠神经功能评分和BIVP（±s）

注：与S组比较，■P＜0.01；与IR组比较，★P＜0.01；与Pc－24 h 100 mg组比较，▲P＜0.01

组别 神经功能评分（n＝24）BIVP（%）（n＝8）00 0 IR组 8.37＋0.49■ 26.63＋0.92■Pc－24 h 100 mg组 8.95＋0.55■★ 22.75＋0.71■★Pc－24 h 200 mg组 9.20＋0.41■★ 22.62＋0.91■★Pc－24 h 400 mg组 11.95＋0.62■★▲ 20.75＋1.28 S组 18.00＋0.■★▲

表2 各组大鼠脑组织含水量及MDA水平（±s，n＝8）

表2 各组大鼠脑组织含水量及MDA水平（±s，n＝8）

注：与S组比较，■P＜0.01；与IR组比较，★P＜0.01；与Pc－24 h 100 mg组比较，▲P＜0.01

组别 脑组织含水量（%）MDA（umol·g－1 Pro）27 IR组 91.37＋3.25■ 5.14±0.65■Pc－24 h 100 mg组 88.12＋2.94■★ 4.55±0.41■★Pc－24 h 200 mg组 86.37＋3.62■★ 4.31±0.63■★▲Pc－24 h 400 mg组 79.50＋2.82■★▲ 4.16±0.05 S组 75.25＋2.18 1.82±0.■★▲

2.2 BIVP与MDA水平及脑组织含水量相关性分析 在IR组及葛根素预处理3组中将BIVP与大鼠脑组织MDA水平及脑组织含水量作相关分析显示BIVP与脑组织MDA水平及脑组织含水量呈正相关（r＝0.744，P＝0.005，r＝0.901，P＝0.002）。

3 讨 论

局灶性脑缺血时缺血半暗带及邻近脑组织内继发出现微细血管收缩，细胞内线粒体膜的稳定性下降，细胞膜的失稳定使进入细胞内的游离水增多，能量代谢紊乱程度加重，使炎症因子释放增多，血脑屏障通透性增高，缺血脑组织含水量增多，该过程伴随脑组织生物膜结构及内源性抗氧化系统受损，活性氧大量堆积，再灌注过程中缺血脑组织重新获氧，激活黄嘌呤氧化酶，自由基清除动态平衡破坏，导致细胞膜的脂质过氧化反应引起氧自由基的过多生成，对自发性高血压性脑卒中倾向大鼠脑缺血模型研究表明，氧化应激是导致脑缺血再灌注损伤的重要机制［9］。生物膜中不饱和脂肪酸的氧化作用导致脂自由基的形成和延伸反应，MDA为生物膜中的多不饱和脂肪酸脂质过氧化后的终产物，检测MDA水平可反映脑组织中氧自由基水平和脂质过氧化的程度，间接地反映了线粒体呼吸链损伤的程度［10］。研究表明葛根素可以通过降低局灶性脑缺血大鼠中纹状体兴奋性氨基酸含量而对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用［11］。

本研究模型组脑含水量显著高于假手术组，表明大脑中动脉线栓导致了脑水肿，葛根素100 mg／kg、200 mg／kg及400 mg／kg组脑含水量明显低于IR组，提示葛根素预处理可以减轻脑缺血再灌注后脑水肿。实验中对葛根素预处理进行了剂量相关研究，提示葛根素100 mg／kg、200 mg／kg及400 mg／kg三个剂量均具有保护作用，但随着剂量增加，特别是葛根素400 mg／kg剂量预处理对神经功能评分明显改善，本研究中BIVP与脑组织MDA及含水量呈正相关，间接印证了葛根素预处理可能通过氧化应激过程及脑水肿发生机制来缩小脑梗死体积。故本研究推测，葛根素可能通过清除氧自由基、抗氧化及减少脂质过氧化机制，提高脑组织抗氧化能力，进而保护线粒体免于遭受进一步的破坏，减轻脑组织含水量，并最终发挥脑保护作用，其中部分剂量依赖对葛根素临床应用具有一定启发作用。

本实验初步证实了葛根素预处理能减轻局灶性脑缺血再灌注的脑保护机制可能与抑制MDA产生及抗脑水肿有关，为临床早期应用葛根素提供了重要的实验依据，也间接推测葛根素作为中药制剂可能为天然抗氧化剂？为今后葛根素预防性应用脑梗死高危人群提供一定的理论依据。

图1 各组大鼠脑组织冠状位切片TTC染色

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2 Lee HC，Hsieh CL，Chen CC，et al.A pilot study in acute subarachnoid haemorrhagic patients after aneurysm clipping with complementary therapies of Chinese medicine.Complementary Therapies in Medicine，2010，18（5）：191－198.

3 Tu Q，Wang R，Ding B，et al.Protective and antioxidant effect of Danshen polysaccharides on cerebral ischemia／reperfusion injury in rats.Int J Biol Macromol，2013，60（9）：268－271.

4 吴海琴，常明则，张桂莲，等.葛根素对大鼠全脑缺血再灌注后学习记忆障碍保护作用及其机制的研究.中风与神经疾病杂志，2004，21（4）：350－352.

5 常明则，王新来，吴海琴.葛根素对血管性痴呆大鼠行为学及额叶细胞凋亡的影响.卒中与神经疾病，2009，16（3）：151－154.

6 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle.cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（1）：84－91.

7 乔 琳，胡 彬，常明则，等.二种神经功能评分评价大鼠局灶性脑缺血模型的初步研究.山西医科大学学报，2012，43（12）：808－811.

8 Garecia JH，Wagner S，Liu KF，et a1.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation .Stroke，1995，26（4）：627－634.

9 Zhang XH，Lei H，Liu AJ，et al.Increased oxidative stress is responsible for severer cerebral infarction in stroke－prone spontaneously hypertensive rats.CNS Neurosci Ther，2011，17（6）：590－598.

10 Karabulut AB，Kirimlioglu V，Kirimlioglu H，et al.Protective effects of resveratrol on spleen and ileum in rats subjected to ischemia－reperfusion.Transplant Proc，2006，38（2）：375－377.

11 Xu XH，Zheng XX，Zhou Q，et al.Inhibition of excitatory amino acid efflux contributes to protective effects of puerarin against cerebral ischemia in rats.Biomed Environ Sci，2007，20（4）：336－342.