几种基于PCR的分子标记在甘薯遗传多样性研究中的应用

何虎翼， 谭冠宁， 何新民， 何海旺， 李丽淑， 唐洲萍， 王 晖

广西农业科学院经济作物研究所，南宁530007

广义上来说，遗传多样性是指种内或种间表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传变异度。在研究甘薯遗传多样性时，多采用其狭义上的含义，即指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度。遗传多样性是维持生物繁殖活力、抗病虫害能力和适应环境变化的基础，也是人类改良和创造新栽培植物的源泉。为了分析植物遗传多样性，人们已经从形态学水平、细胞学水平、生化水平和分子水平进行了深入研究。由于DNA分子标记具有数量极大、不受环境及基因表达与否限制、利于隐性性状选择、不影响目标性状表现等优点，现已在遗传多样性研究中得到广泛应用。

双子叶植物甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)属旋花科甘薯属，是世界上重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物。甘薯在中国已有400多年栽培历史，种植面积占世界的65.4%，产量占85.9%。在目前育成的甘薯品种中，约94%具有南瑞苕和冲绳100号的血缘，遗传基础相当狭窄，严重影响新品种选育工作。虽然已经保存了近600份甘薯地方品种，但这些地方品种的遗传多样性没有明确。在分析地方品种遗传多样性基础上拓宽育种材料的遗传背景，有助于优良亲本的选择和辅助育种，对甘薯品种遗传改良具有重要意义。

1 分子标记技术概述

DNA分子标记技术研究始于19世纪80年代，现有的分子标记技术已有数十种。由于甘薯染色体数目多且小，存在自交不亲和及同一不育群体内品种间杂交不亲和问题，其遗传背景复杂，农艺性状的观察和分析难以真实反映其亲缘关系，而DNA分子标记不受环境影响，稳定性好，已经成为甘薯种质资源研究的重要手段。目前在甘薯育种研究中主要采用以PCR扩增技术为基础的RAPD、AFLP和ISSR标记。

随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是以10 bp左右的随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，经凝胶电泳分离、染色来显示扩增 DNA片段多态性［1］。RAPD标记不依赖于种属的特异性，操作简单，成本较低，DNA样品用量少，复性温度低，但难以区别纯合体和杂合体，易受反应条件影响，扩增稳定性和实验重复性差。扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是将基因组DNA用限制性内切酶双酶解后，将双链人工接头连接到酶切后的片段的两端，用带有选择性碱基的引物进行选择性扩增，产生不连续的DNA产物，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测DNA序列的多态性［2］。AFLP标记多态性高，模板用量少，稳定性好，但技术受专利保护，DNA纯度和内切酶质量要求高。简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)是根据相对保守的微卫星DNA两端单拷贝序列设计一对特异引物，通过PCR反应扩增微卫星片段来揭示微卫星DNA的多态性［3］。SSR标记多态性频率高，多为单一多等位基因位点，可鉴别纯合和杂合基因型，重复性高，稳定可靠，DNA用量少，但引物设计是其难点。简单重复序列间扩增(inter-simple sequence repeats，ISSR)就是在SSR的3'端或5'端加锚1～4个嘌呤或嘧啶碱基，并以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增，经电泳、染色，根据谱带的有无及相对位置来分析样品间的多态性［4］。ISSR标记是共显性，成本较低、重复性好、多态性较高，其缺点在于需要摸索PCR最适反应条件，不能用来区分纯合和杂合基因型。相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)通过独特的双引物设计对基因的ORFs的特定区域进行扩增［5］。SRAP标记在基因组中均匀分布，多态性强，DNA用量少，效率高、共显性、重复性好，但没有利用扩增区域序列的任何信息，产生的标记随机分布在染色体上。上述均为基于PCR扩增的分子标记技术，DNA用量均在0.2 g左右，各自特点对比见表1。

表1 几种基于PCR的DNA分子标记技术的比较Table 1 Comparison of several PCR-based DNA molecular markers.

2 遗传差异分析

在甘薯育种中，为了有效利用优异种质资源，必须首先对甘薯种质资源亲缘关系和遗传多样性进行评价。随着DNA分子标记的迅速发展，各种分子标记技术都已应用于甘薯遗传多样性分析中(见表2)。

2.1 甘薯地方品种与主要育成品种的遗传差异分析

李强等［12］用10对 AFLP引物和17条 ISSR引物对26份中国甘薯主要育成品种进行遗传多样性分析时，发现中国甘薯主要育成品种间遗传相似度高，南方薯区品种遗传差异高于北方薯区和长江中下游薯区，通过加强不同薯区育种亲本交换可以逐步改变中国育成品种遗传基础狭窄现状。张超凡等［16］利用12对SSR引物对31份湖南甘薯品种进行遗传多样性分析，发现每对引物可获得6个等位基因位点，因此，湖南甘薯品种遗传多样性较丰富。宋吉轩等［21］利用7个ISSR引物对收集的45份贵州甘薯种质资源进行遗传多样性分析，发现它们之间亲缘关系较近。

表2 甘薯遗传多样性的相关报道Table 2 The related reports of sweet potato genetic diversity.

2.2 我国甘薯种质资源保存与多样性分析

利用20对SSR引物对24份甘薯材料进行遗传多样性分析，赵冬兰等［17］发现离体保存5年和8年的效果相同，我国保存的甘薯种质资源还是较丰富的。罗文彬等［22］利用15个ISSR引物检测34份甘薯种质资源遗传多样性，并划分为4大类，明确了所保存的甘薯种质资源的遗传背景。为了解不同用途甘薯种质资源遗传多样性，陈新起等［23］利用11个ISSR引物对10个菜用甘薯材料进行遗传多样性分析，显示菜用甘薯材料遗传差异较大，为菜用甘薯杂交亲本选配提供依据。黄洁等［24］利用17对 ISSR引物对21份紫肉、28份红黄肉甘薯种质资源进行遗传多样性分析，发现紫薯和红黄薯具有不同的来源，同一育种单位的品种亲缘关系较近。

2.3 甘薯的起源与进化研究

贺学勤等［6］用30个RAPD引物、9对 AFLP引物和14个ISSR引物对来自安徽、福建、河南和广东的48个甘薯地方品种进行遗传多样性分析，揭示中国是甘薯的次生多样性中心，作为最早引入地，广东的地方品种遗传变异高，可重点加以利用。利用AFLP标记技术，Zhang等［14］对来自拉丁美洲4个不同地理区域的马铃薯品种开展遗传多样性分析，结果表明中美洲是甘薯多样性的第一中心，秘鲁－厄瓜多尔被认为是甘薯多样性的第二中心。Huang和Sun［25］对40个番薯属植物进行分析，发现高多态性ISSR标记能更好地实现种内分离，进而推断出Ipomoea triloba是甘薯的祖先之一。在育种中，常需要将栽培种与野生种进行差异比较。Hu等［26］用8个ISSR引物评估34个甘薯栽培种或野生种的遗传多样性和亲缘关系，认为ISSR标记适合于栽培甘薯和野生种的指纹分析，可用于构建甘薯连锁图谱。

2.4 甘薯品种的地域差异分析

Liu等［13］利用AFLP标记技术对中国主要甘薯品种进行遗传多样性研究，发现遗传变异主要存在于区域内，区域间的变异水平非常低。但以长江为分界线，北方地区和南方地区甘薯品种之间存在显著的遗传变异。郝玉民等［29］利用6对SRAP引物对36个甘薯品种进行了遗传多样性分析，发现亚洲品种和美洲品种、近缘野生种与育成品种、中国育成品种之间有较高的遗传相似度。李强等［27］用17个ISSR引物对62份甘薯主要亲本材料进行遗传多样性分析，表明中国自育亲本与外引亲本间遗传距离较远，在未来育种中，可以用国内自育亲本与外引亲本、亚洲亲本与其他外引亲本配制杂交组合。

2.5 国外品种资源的遗传多样性分析

用引物SP20、SP06、A69和 A71检测印度尼西亚东爪哇省12个甘薯品种的遗传多样性，可分成两大类，但其中3个品种没有扩增条带，无法做进一步鉴定［7］。Moulin 等［8］用 18 个 RAPD 引物和19个ISSR引物，对来自巴西里约热内卢农村和当地市场82个甘薯品种进行遗传多样性分析，遗传相似系数分别为0.80和0.89，表明传统农户保存甘薯品种有很好的遗传多样性。Elameen等［15］对97个坦桑尼亚甘薯种质进行遗传多样性分析，结果显示 AFLP标记可用来检测所收集种质的重复性，是描述甘薯种质资源遗传多样性和亲缘关系的有效工具。为了解不同地理环境条件下甘薯种质资源亲缘关系，吴觐宇等［28］利用10个ISSR引物对25份美国甘薯材料进行遗传多样性分析，发现这些材料遗传多样性较高，其中6-3-1、6-8-7可用于国内甘薯育种。

3 亲缘聚类分析

除用于甘薯遗传差异分析外，分子标记也可用于甘薯种质亲缘关系分析。在谱系亲缘关系分析中，15种RAPD随机引物可将17个甘薯品种及其近缘野生种聚类成三个类群，三裂叶野牵牛单个野生种组成A类群，B类群由四倍体和六倍体三浅裂野牵牛及12个甘薯品种组成，海滨野牵牛和二倍体三浅裂野牵牛组成C类群［9］。用26个多态性引物对中国30个甘薯主栽品种RAPD聚类分析表明，地域分布相近的甘薯品种或具有同一亲本的甘薯品种聚类在一起［10］。利用RAPD分子标记获得的育成品种聚类结果表明，地方品种中“四季种”和“保亭种”遗传距离最近，地方品种与中国主要育成品种遗传距离较远，这与已知甘薯品种系谱图吻合度较高［11］。Veasey 等［18］调查巴西圣保罗传统农业家庭78个甘薯品种，SSR聚类分析表明高遗传和品种内多样性。Yada等［19］用10对荧光标记的SSR引物分析192份乌干达甘薯种质，表明聚成的四大类没有明显的起源亲缘关系，约190个可作为潜在的父母本基因型。吴洁等［30］利用30对SRAP引物对86份甘薯种质资源进行亲缘关系分析，结果表明这些甘薯种质资源可分为四大类，其中四川省育成的甘薯品种遗传范围较狭窄。

在遗传多样性与性状特征标记方面，Koussao等［20］用28对SSR引物评估非洲布基纳法索112个甘薯品种的多样性，发现遗传相似系数为0.49，与形态特征标记之间没有相关性。为了分析48份主要甘薯种质资源遗传多样性，张凯等［31］利用37对SRAP引物进行检测，发现SRAP标记聚类结果与系谱吻合，但与依据农艺性状聚类结果相差较大，且种质资源间遗传差异与地理来源无关。

4 展望

理想的分子标记要求具有高多态性、共显性遗传、均匀遍布整个基因组、成本低廉、重复性好、检测快捷、能辨别等位基因等特点。通过对几种基于PCR技术的分子标记进行比较分析发现，与SSR标记相比，ISSR引物开发费用低，可以在不同物种间通用。与RAPD单引物相比，ISSR揭示的多态性百分率较高，且由于其具有较高的退火温度、重复性好、稳定性高［32］。相对于AFLP而言，ISSR费用较低，反应体系具有一定的通用性，操作简单，可广泛应用。ISSR揭示的地区内(间)品种间的遗传差异水平高于RAPD和AFLP，这可能是由于在甘薯属中存在大量的微卫星变异造成的［33］。与SRAP相比，ISSR所用引物更少，效率更高。不同分子标记间遗传多样性参数比较分析结果表明，ISSR和 SSR参数值间差异显著，与RAPD、AFLP不宜直接比较，而RAPD和AFLP参数间可以直接比较［34］。ISSR既可以区分遗传相似系数较近的甘薯品种资源，也能区分遗传距离较远的甘薯种质资源，是一种共显性、成本较低、重复性好、多态性较高、非常有发展前途的分子标记，已广泛应用到基因组作图和基因定位、物种亲缘关系和系统分类、基于图谱克隆基因和辅助育种等研究中。

对表2总结的已有研究结果做进一步比较分析，发现ISSR标记所需引物数量最少，一般为12～15条;从多态性百分率来看，RAPD最高，其次是SRAP和ISSR，AFLP最低;AFLP的遗传相似系数变化范围最大，ISSR次之，RAPD、SRAP和SSR相差不大;从单引物能区分的种质资源数量来看，ISSR最多，其次是 AFLP和 SSR，SRAP最少。贺学勤等［6］分析了48个甘薯地方品种遗传多样性，认为ISSR退火温度较高，稳定性好，在分析甘薯遗传多样性方面要强于RAPD，这与Chowdhury等［32］的结论一致。通过比较 RAPD、ISSR和AFLP三种分子标记在检测甘薯品种间遗传差异上的应用效果，贺学勤等［35］发现ISSR标记估计的品种间遗传距离大于RAPD和AFLP标记的估计值，ISSR标记更适于分析甘薯品种的亲缘关系。通过对26份中国甘薯主要育成品种进行遗传多样性分析，李强等［12］发现虽然AFLP标记引物在每个品种中扩增条带数平均比ISSR标记多6条，但ISSR标记扩增多态性条带比AFLP标记高27.19%。Moulin等［8］对来自巴西里约热内卢农村和当地市场82个甘薯品种进行遗传多样性分析，发现ISSR和RAPD这两种标记结果有较好的一致性。虽然ISSR标记多态性比RAPD标记略低4.3%，但表型相关系数比RAPD标记高出0.09。综合考虑，ISSR标记遗传多态性相对较好，可以实现用最少的引物来区分数量最多、遗传距离较远的甘薯种质资源。值得注意的是，在将ISSR标记技术应用于不同作物时，需要探索PCR反应最适条件。

在上述有关甘薯研究的19篇相关文献中，应用RAPD有6篇，AFLP有5篇，SSR有5篇，ISSR有11篇，SRAP有3篇，这表明ISSR分子标记技术已经被广泛应用到甘薯遗传多样性分析中。它不仅被用来分析国内甘薯品种遗传差异，也用于分析国外甘薯材料遗传多样性;或用于分析不同用途甘薯种质资源遗传多样性，还可用于分析不同地域甘薯种质资源的亲缘关系。随着甘薯品种改良工作的不断推进，为适应甘薯品种抗多种病虫害、用途多样化的需求，未来分子标记将会成为揭示甘薯种质资源遗传多样性的重要技术手段。由于ISSR标记技术的广阔应用前景，今后我们应该加强ISSR标记技术的应用研究，通过与提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化相结合，开发出成本更低、分析速度更快、信息量更大的分子标记技术，以期为遗传多样性研究和评估提供强大支持。

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