Box-Behnken设计-效应面法优选双百安神胶囊提取工艺

万 丹，张水寒*，蔡 萍，肖 娟，佘高照

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410008；2.杨永华全国名老中医药专家传承工作室，湖南 长沙 410008；3.湖南龙山县现代中药材开发有限责任公司，湖南 龙山 416800）

Box-Behnken设计-效应面法优选双百安神胶囊提取工艺

万 丹1，2，张水寒1，2*，蔡 萍1，2，肖 娟1，2，佘高照3

（1.湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410008；2.杨永华全国名老中医药专家传承工作室，湖南 长沙 410008；3.湖南龙山县现代中药材开发有限责任公司，湖南 龙山 416800）

目的 对双百安神胶囊提取工艺进行优化。方法 以酸枣仁总皂苷、干膏得率为评价指标，以加醇量、乙醇浓度、提取时间为考察因素，采用Box-Behnken-效应曲面法，优选双百安神胶囊提取工艺参数。结果 通过Box-Behnken设计效应面法所得模型优化提取条件为：第1次加7倍量60%乙醇，提取2 h；第2次加6倍量60%乙醇，提取1.5 h。结论 采用效应面法优选的双百安神胶囊提取工艺合理可行。

双百安神胶囊；Box-Behnken设计；提取工艺

双百安神胶囊系由湖南省中医药研究院与湖南龙山县现代中药材开发有限责任公司合作研发的一种新型的保健药品，主要由百合、百合花、酸枣仁等药味组成，用于改善睡眠、调节情志、治疗大脑神经功能紊乱引起的失眠多梦、忧郁烦躁、幻听恐惧等症，具有养心安神，疏肝泻火的功效。本文采用Box-Behnken设计-效应面法，以酸枣仁总皂苷、干膏得率为评价指标，优选双百安神胶囊的提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外可见分光光度计UV-2450(日本岛津)。

1.2 试药

购自湖南省药材公司饮片厂及湖南龙山县现代中药材开发有限责任公司；酸枣仁皂苷A对照品（中国药品生物制品检定所，批号:110734-200509，供含量测定用），其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 干膏得率的测定[1]

精密吸取提取液样品适量，至已恒重的蒸发皿中水浴蒸干，按《中华人民共和国药典》2010年版一部附录干燥失重法测定，计算干膏得率。

2.2 酸枣仁总皂苷含量的测定[2-4]

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取酸枣仁皂苷A对照品5.5 mg，加甲醇制成0.55 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 标准曲线绘制 分别精密吸取酸枣仁皂苷A对照液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置于具塞试管内，挥干溶剂，再分别加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，混匀、密塞，置60℃恒温水浴中显色15 min，取出后立即以冰水冷却5 min，各加入冰醋酸5.0 mL，摇匀，静置10 min，以试剂空白为参比，于波长546 nm处测其吸光度。以酸枣仁皂苷A质量为横坐标（X），吸光度A为纵坐标（Y），绘制酸枣仁皂苷A标准曲线，结果表明:酸枣仁皂苷A对照品在0.11～1.1 mg范围内线性关系良好，得线性方程:

2.2.3 供试品溶液的制备和测定 精密量取已定容的提取液50 mL，水浴蒸干，取适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇溶解，吸取百合等提取液各1.0 mL，置于具塞试管内。按“2.2.2”项下方法，测定其吸光度。

3 工艺研究

3.1 提取次数考查

按处方的1/100量称取药材，约175 g，加入60%乙醇提取3次，依次加药材8、7、6倍量乙醇提取2.0 h，滤过，分别收集滤液浓缩并定容至50 mL，依据测定干膏得率、酸枣仁总皂苷提取量，结果见表1。

结果表明:第3次提取的干膏得率、酸枣仁总皂苷提取量分别占3次总提取数的8.8%、2.2%，考虑到生产成本与效率问题，应以提取2次为宜。

表1 提取次数考查结果

3.2 Box-Behnken-试验设计

在预实验基础上，确定影响双百安神胶囊提取工艺的因素主要有加醇倍数、乙醇浓度、提取时间及提取次数。但因提取次数为非连续变量[5]，在模型拟合中处理较困难，结合单因素考察实验结果，确定提取次数为2次。根据Box-Behnken实验设计原理，本实验选取加醇倍数 （A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）三因素为自变量，以干膏得率（Y1）、酸枣仁总皂苷提取量（Y2）两个指标为效应值，采用3因素3水平的效应面分析方法进行分析，试验设计及结果见表2。

表2 Box-Behnken设计及响应结果

3.3 结果

3.3.1 多元二次效应面回归模型的建立与分析 采用Minitab 16.0软件对表2建立多元二次效应面回归模型，得拟合方程Y1=-116.88+4.954A+2.795B+ 12.04C+0.02300AB-0.2038AC-0.06400BC-0.1949A2-0.02528B2-0.7746C2，Y2=-212.05+4.726A+6.401B+ 19.37C+0.09775AB-0.2262AC-0.08400BC-0.3121A2-0.06342B2-1.5158C2。结果见表3。

表3 二项式回归模型方差分析结果

由方差分析可知，对于Y1和Y2这2个指标，模型方程Y1的P值为0.014（P<0.05），Y2的P值为0.005（P<0.01），表明实验所采用的二次模型具有统计学意义。失拟项 P值分别为 0.059、0.090，均> 0.05，无明显失拟因素存在，可充分反映实际情况。针对上述方程各项系数的显著性进行的统计检验，结果Y1模型方程中A项的P值为0.003<0.01，B、C、A2、B2、C2项的P值<0.05，说明这几项具有显著性影响，剩余项均>0.05，说明无显著性影响。Y2模型方程中A、B项的P值分别为0.001、0.002<0.01，C、B2、C2项的P值<0.05，说明这几项具有显著性影响，剩余项均P>0.05，说明无显著性影响。

3.3.2 效应面优化与预测 根据优化后的二项式方程，运用Minitab软件作三维效应面图（见图1）。根据二项回归方程，计算出优化条件:A=13.38，B= 60%，C=3.5 h， 可预测出 Y1为 19.5%，Y2为49.9 mg。Y1合意性为0.97，Y1合意性为0.99，复合合意性为0.98。考虑到实验操作的科学性，最优工艺设计为加醇倍数为13倍，乙醇浓度为60%，提取时间为3.5 h。

图1 各因素与响应值的三维图

3.3.3 验证试验 按处方的1/100量称取药材3份，据最佳工艺条件提取样品，测定Y1和Y2。Y1结果分别为19.49%、19.18%、19.61%，平均干膏得率为19.4%。Y2分别为48.85、49.38、49.74 mg，平均含量为49.3 mg。验证试验结果与与理论值比较，Y1和Y2相对偏差分别为0.4%、1.1%，表明优选工艺提取效果较为理想。

4 讨论

酸枣仁中皂苷类成分为镇静、催眠的主要药效成分，对睡眠的改善有很好的效果。且药理研究表明酸枣仁总皂苷能减少小鼠自发活动，协同苯丙胺的中枢兴奋作用，其中枢抑制作用也呈剂量依赖性[6]，所以本实验以酸枣仁总皂苷为指标成分，对双百安神胶囊提取工艺参数进行优选。

本试验采用适合于非线性拟合Box-Behnken-效应面法优选百安神胶囊最佳提取工艺，得出加醇倍数、乙醇浓度、提取时间对酸枣仁总皂苷提取率和干膏得率的效应趋势，从实验结果可知，加醇倍数、乙醇浓度、提取时间对提取工艺有显著影响，但各因素之间并无交互作用。试验优选的提取工艺，能降低能耗、节约原料，且可提高双百安神胶囊有效成分提取率，为成功研发出双百安神胶囊提供实验依据。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010:附录Ⅸ G.

[2]王筱亮，张玉杰，陈明霞，等.多指标正交试验优选酸枣仁最佳提取工艺[J].中国中药杂志，2005，30(10):753-755.

[3]高声传，郭 涛，夏维杰，等.比色法测定酸枣仁提取物中总皂苷的含量[J].实用药物与临床，2005，8(1):15-16.

[4]程小丽，张 伟.酸枣仁总皂苷的提取分离及含量测定[J].陕西中医，2012，33(5):607-609.

[5]顾媛媛，王建明，宋成贵，等.星点设计-效应面法优选凤仙透骨草的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）:59-61.

[6]郑 晔，钱苏瑜，游自立.酸枣仁药理作用研究进展[J].四川生理科学杂志，2006，28（1）:35-37.

（本文编辑 杨 瑛）

Optimization of extracting technology for Shuangbai Anshen Capsule by Box-Behnken design and response surface method

WAN Dan1,ZHANG Shuihan1*,CAI Ping1*,XIAO Juan1,2,SHE Gaozhao3
(1.Research Institute of Chinese Medicine,Hunan Academy of CM,Changsha,Hunan 410008, China;2.The Inheritance Studio of Yang Yong-hua,the Famous TCM eχperts,Changsha,Hunan 410008,China;3.Modern Traditional Chinese Medicine Development co.,LTD,Longshan County, Hunan Province,Longshan,Hunan 416800,China)

Objective To optimize the extracting technology of Shuangbai Anshen Capsule. Methods The total saponins of semen ziziphi spinosae(szs)and extract yield used as indices,the extracting technology of Shuangbai Anshen Capsule was optimized by Box-Behnken design and response surface method from the aspects of ethanol amount,ethanol concentration,and extracting time.Results The preferred processing conditions were as follows:add 7 times of 60%alcohol, extracted for 2 h,and then add 6 times of 60%alcohol,extracted for 1.5 h.Conclusion The extracting technology optimized by Box-Behnken design and response surface method is reasonable and feasible.

Shuangbai Anshen Capsule;Box-Behnken design;extracting technology

R283.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.006.022.03

2013－09－30

湖南省科技厅重点项目(2013NK2008)；“十二五”国家科技支撑计划子课题(2011BAD10B01)。

万 丹，女，实习研究员，研究方向:中药新制剂与新技术。

*张水寒，女，研究员，E-mail:zhangshuihan0220@126.com。