福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型的建立及其背根神经节辣椒素受体表达水平

贺渊哲，邵先舫，熊 辉，刘志军，李 前，严 望，汤思敏

（1.湖南中医药大学附属常德医院，湖南 常德 415000；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型的建立及其背根神经节辣椒素受体表达水平

贺渊哲1，2，邵先舫1，熊 辉3，刘志军1，李 前1，严 望1，汤思敏2

（1.湖南中医药大学附属常德医院，湖南 常德 415000；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的 评价福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型的疼痛行为学表现，并对该模型大鼠背根神经节辣椒素受体表达水平进行分析。方法 SD大鼠24只，随机分为2组，即对照组（n=12）及福尔马林模型组（n=12）。对照组不予处理，福尔马林模型组于左后足底注射5%福尔马林0.1 mL，观察造模后大鼠疼痛行为学反应，并以Dubuisson评分方法进行记录比较；2组大鼠在指定时间点取出L3-6节段背根神经节，运用RT-PCR、蛋白质印迹（Western blot）检测辣椒素受体在大鼠背根神经节中的表达水平。结果 福尔马林模型组大鼠呈典型的双相伤害性行为反应，大鼠疼痛反应120 min内积分在5～1，对照组无疼痛反应。福尔马林模型组大鼠背根神经节辣椒素受体表达水平显著增加，与对照组比较有显著性差异（P＜0.05﹚。结论 福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型可以产生持续的、可信的痛觉过敏，并诱导大鼠背根神经节辣椒素受体表达水平增加，是研究组织损伤诱发炎性疼痛机制的较佳模型选择。

福尔马林炎性疼痛；辣椒素受体；背根神经节

1997年由Dubuisson与Dennis创立的，引起实验动物持续的炎性疼痛[1]的福尔马林注射足底方法，已经得到国内外学术界的公认，广泛应用于疼痛机制的研究。辣椒素受体是一个能被辣椒素激活的受体，属于瞬时感受器电位（transient receptor potential，TRP）家族，当其与配体结合后，通道开放，阳离子(尤其是钠离子和钙离子)从胞外进入胞内，引发了一系列生物学效应[2]。辣椒素受体广泛分布于哺乳动物的感觉神经纤维，尤其是无髓鞘的C类和部分少髓鞘的A类纤维中[3]。辣椒素受体能被多种理化刺激激活，参与人体内如咳嗽、疼痛、炎症等生理或病理过程[4-7]。本研究旨在复制福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型，观察其疼痛行为学表现，并利用实时荧光定量（RT-PCR）和Western blotting的方法观察辣椒素受体在大鼠炎性疼痛模型背根神经节中的表达情况，为课题组下一步研究镇痛药物的机制奠定基础。现将方法与结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物及试剂 一抗 （Anti-VR1 antibody ab74855），（厂家:abcam，代购公司:长沙奥星医疗科技有限公司）；二抗（HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)），（厂家:abcam，代购公司:长沙奥星医疗科技有限公司）。

1.1.2 主要仪器动物 DYCZ-40D湿式转膜装置（北京六一仪器厂），HAD-T10电动组织分散仪 （北京恒奥德），JY3000核酸电泳仪 （上海达平），UV-19紫外分光光度计（上海析谱），GTR16-2冷冻离心机（北京时代兆利离）。实验动物来源合格证:syxk（湘）2009-0001，实验动物使用合格证号:scxk（湘）2011-0003。

1.2 建模及分组[8]

健康雄性SD大鼠24只，体质量250～280 g，购于湖南中医药大学实验动物中心。动物一般状态良好，皮毛光泽，进食与活动正常。适应性喂养5 d后进行实验。随机分为对照组和模型组，每组12只。

用微量注射器抽取5%福尔马林0.1 mL注入模型组大鼠左侧后足底皮下建立大鼠炎性疼痛模型，空白对照组不予任何处理。造模完成后在饲养箱底成45°夹角放置一面镜子以便观察动物后肢的活动情况。

1.3 痛行为观察及分级评价[3-4]

于注射福尔马林后 1、5、15、30、45、60、90 min及120 min分别观察每只大鼠的疼痛反应，按下述标准进行疼痛分级并记录 0分:注射福尔马林一侧后足与对侧后足均接触底面，行走自如；1分:两侧后足均接触底面，但行走时注射侧轻微跛行；2分:两侧后足均接触底面，但身体重心在健侧，行走时注射侧明显跛行；3分:注射侧后足轻微接触底面，但不敢负重，行走时抬起；4分:注射福尔马林一侧后足抬起，不接触任何表面；5分:大鼠舔、咬、抖动注射福尔马林一侧后足。

1.4 组织标本的取材与处理[10-11]

大鼠于造模后24、48、72 h，每次每组取3只，腹腔注射水合氯醛麻醉，解剖暴露大鼠脊柱，定位L3-6椎体，取出定位节段，纵向打开椎管，暴露背根神经节，依次取出，置入2 mL冻存管中，迅速保存于液氮中，后转入-80℃冰箱中备用。

1.5 RT-PCR检测

采用RT-PCR方法对背根神经节中辣椒受体mRNA表达水平进行检测。总RNA提取:样本用液氮在研钵中研磨成粉状，按照TRIzol试剂说明书提取标本总RNA，并溶于DEPC水，各标本总RNA用 l%的琼脂糖凝胶电泳法检测其质量；以DEPC水作空白对照，用紫外分光光度仪测定RNA浓度及样本A260与A280比值，检测其纯度。每个样本分别取1 μg总RNA进行反转录。cDNA的合成:选用Random hexamer primer 1 μL，加无核酶水至12 μL；5×reaction buffer 4 μL，RiboLockTMRNase Inhibitor(20 U/μL)，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transciptase(200 U/μL)，总反应体系为 20 μL。经 25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min后反转录为cDNA，置于-80℃冰箱中保存备用。本实验选用内参基因为:正向引物:5'-CCAGCCATGTACGTFGCTATC-3反向引物:5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'，辣椒素受体上游引物:5'-ATCGAGCTCATGGAACAACGGGCTAGCTTAG-3'下游引物:5'-ACTGGTACCTATTTCTCCCCTGGGACCAT-3''，实验结果以2-△△CT表示，得出“±s”进行统计分析。

1.6 蛋白质印迹（Western blot）检测

1.6.1 组织总蛋白的提取 背根神经节组织剪切成细小的碎片。每100 mg组织加入1 mL RIPA裂解液。用机械匀浆器匀浆。冰上放置30 min，-80℃冻融2次。超声波处理，打断DNA。12 000 r/min离心10 min。吸取上清液，蛋白定量，分装，保存在-80℃备用。

1.6.2 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 按照安装玻璃板→配制10%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液→分离聚胶→吸水→制备浓缩胶→浓缩胶聚合完全→按自己设计的点样顺序点样→连接电源进行电泳→卸下玻璃板，紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位的顺序进行蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.6.3 免疫印迹 将封闭的PVDF膜TTBS漂洗2次，加入用5%脱脂奶粉稀释 (浓度为1∶500)的辣椒素受体多克隆抗体中，4℃下反应过夜，TTBS漂洗PVDF膜10 min×4次，加入1∶2 000稀释的二抗，室温下孵育 60 min，TTBS漂洗 PVDF膜 10 min×4次，最后经 ECL发光液显影，X线胶压片后送自动X线洗片机洗片。以每条蛋白电泳带的灰度值表示辣椒素受体蛋白的表达量。

1.7 统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计量资料以“±s”表示。结果应用t检验方法进行统计学分析，等级资料用秩和检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 福尔马林模型组、对照组疼痛行为学表现结果

福尔马林模型组大鼠左侧后肢足底皮下注射5%福尔马林0.1 mL后呈典型的双相伤害性行为反应，出现躁动不安、不时尖叫、注射足抬起不着地、舔咬或抖动注射足等反应。其伤害性行为学痛反应呈典型的双相变化，即注射后即刻开始，持续约3～ 5 min的急性疼痛时相(第一时相)，约5～10 min的静息期，和随后出现的可持续40～60 min的继发性疼痛一时相(第二时相)[10]。结果见图1。对照组无上述疼痛行为，疼痛反应积分为0。

图1 注射福尔马林后不同时间模型组大鼠疼痛评分折线图

2.2 RT-PCR检测结果

福尔马林模型组背根神经节中辣椒素受体m-RNA的表达量相对于对照组上升，差异有统计学意义（P﹤0.05）。结果见表1，图2。

表1 各时间点大鼠背根神经节中辣椒素受体mRNA表达比较 （s，n=3）

表1 各时间点大鼠背根神经节中辣椒素受体mRNA表达比较 （s，n=3）

注:模型组与空白组比较△P<0.01。

组别空白对照组福尔马林模型组1 d 0.264±0.018 1.125±0.035△2 d 0.292±0.012 1.029±0.062△3 d 0.319±0.011 0.910±0.090△

图2 各时间点大鼠背根神经节中辣椒素受体mRNA表达的柱形图

2.3 蛋白质印迹（Western blot）结果

福尔马林模型组及空白对照组每个时相点中随机取3个样本进行蛋白质印迹检测，其辣椒素受体的蛋白质印迹检测表达量条带灰度分析结果示:福尔马林模型组背根神经节中辣椒素受体蛋白的表达量相对于对照组上升，差异比较有统计学意义（P﹤0.05）。结果见表2，图3-4。

表2 辣椒素受体条带灰度分析结果 （±s，n=3）

表2 辣椒素受体条带灰度分析结果 （±s，n=3）

注:与空白组比较#P<0.05。

组别空白对照组福尔马林模型组1 d 0.550 1±0.103 6 0.952 2±0.041 0#2 d 0.540 1±0.107 2 0.963 5±0.052 0#3 d 0.532 8±0.118 7 0.948 0±0.047 0#

图3 各组大鼠背根神经节中辣椒素受体表达柱形图

图4 各组大鼠背根神经节中辣椒素受体的表达电泳图

3 讨论

福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型属经典疼痛造模，模型成功复制率高，造模成功后有明显的行为学变化，其疼痛行为反应表现为双相伤害性行为反应，第一时相是福尔马林直接刺激大鼠伤害性感受器，属短暂的急性疼痛反应，第二时相属继发性伤害性反应，是依赖于外周的炎症发展及中枢神经系统的参与[11-12]。其疼痛表现与临床实际表现相似，目前已在疼痛发生机制及镇痛药物机制中广泛应用。大量研究表明，福尔马林致痛大鼠模型可作为对临床疼痛进行定量研究的模型。本实验采用5%福尔马林注射于大鼠左侧后足底复制福尔马林大鼠炎性疼痛模型，发现大鼠注射福尔马林后，注射足表现出缩腿、舔爪、抖动等反应，且表现为典型双相伤害性行为反应，说明福尔马林大鼠炎性疼痛模型的复制是成功的，为下一步镇痛药物的机制研究动物实验奠定基础。

辣椒素受体是一个配体门控的非选择性阳离子通道，Helliwell等[13]研究表明辣椒素受体广泛存在于背根神经节。Caterina等[14]成功培育出辣椒素受体基因敲出小鼠，其生长发育、繁殖力、运动与行为和正常小鼠一样，对伤害性刺激反应正常，但对外周炎性疼痛反应减弱。本实验结果表明，福尔马林足底炎性疼痛大鼠模型背根神经节辣椒素受体通道蛋白极有可能参与疼痛信号传导，在疼痛发生机制中扮演重要角色，其背根神经节中辣椒素受体的表达水平较空白对照上升，提示背根神经节中辣椒素受体的表达量可能与疼痛的发生相关。本文为课题组下一步研究阵痛药物的机制奠定一定的实验基础，并有待大样本实验验证。

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（本文编辑 杨 瑛）

Establishment of rat model with inflammatory pain induced by formalin and the expression level of capsaicin receptor in dorsal root ganglion

HE Yuanzhe1，2,SHAO Xianfang1,XIONG Hui3,LIU Zhijun1,LI Qian1,YAN Wang1, TANG Siming2
(1.Changde Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changde,Hunan 415000,China;
2.Graduate School,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;
3.Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To evaluate the behavioral manifestations of inflammatory pain in rat model injected with formalin in plantar,and analyze the expression level of capsaicin receptor of dorsal root ganglion in rat.Methods 24 SD rats were randomly divided into model group and control group.12 SD rats in model group were injected with 0.1 mL 5%formalin in the left plantar,other 12 SD rats in controls did not be treated.The pain behaviors were observed,and Dubuisson score method was used.The segments of L3-6 dorsal root ganglion have been taken from rats in a specific time.The expression level of capsaicin receptor of dorsal root ganglionwas detected by RT-PCR and western blotting.Results Formalin injected group showed a typically biphasic nociceptive responses,and had scores from 5～1 in pain response within 5 min(P<0.05). Control group did not have pain response. The expression level of capsaicin receptor of model group was significantly higher than that of the control group(P<0.05).Conclusion The rat model with inflammatory pain induced by the plantar injection of formalin has sustained,crediblehyperalgesia,and hasan increased expression levelofcapsaicin receptor of dorsal root ganglion.It might be a good model for the mechanism study of the inflammatory pain induced by tissue damage.

Inflammatory pain induced by formalin;capsaicin receptor;dorsal root ganglion

R441.1；Q95-33

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.01.003.010.04

2013－12－03

湖南省常德市科技局（2011sk13）。

贺渊哲，男，湖南中医药大学2011级硕士研究生，研究方向:中医药防治创伤修复的研究。

*邵先舫，男，教授，硕士研究生导师，骨科主任医师，E-mail:50529779@qq.com。