正常成年C57小鼠短声诱发听性脑干反应测试方法与波形分析△

李登科 赵立东 郭维维 于宁 孙伟 杨仕明

听性脑干反应(ABR)是听功能研究的重要指标，其可以反应听觉传导通路是否发生病变，以及病变的部位，加上易于操作且不受麻醉的影响，已广泛应用于耳聋动物模型的听功能评估。目前有很多有关敲基因小鼠以及其它因素致聋小鼠听功能的研究[1～8]，但对于ABR反应阈的判断依据各波潜伏期及幅值的分析方法并不统一，为此，本研究选取5周龄听力正常的C57小鼠，以短声为刺激声对实验鼠进行ABR检测，分析ABR各个波的出现频次、潜伏期与阈值，为今后以小鼠为实验动物的听觉研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取听力正常的C57小鼠20只为实验动物(中国人民解放军总医院实验动物中心提供)，雌雄不限，年龄5周，体重13～16 g。

1.2ABR检测 10%水合氯醛0.45 g/kg腹腔注射麻醉动物，37℃温水袋维持正常体温。

动物完全麻醉后，记录电极置于小鼠两耳间连线中点，参考电极插于给声耳垂下，地线插于对侧耳垂下，电极之间阻抗小于3 KΩ。开放声场中扬声器(TDT MF1-1250)放置于距外耳道口1 cm的地方，避免耳机接触耳廓。

采用美国TDT公司TDT III设备和SigGen RP系统软件给声并采集信号。刺激声为click声，强度10～90 dB SPL，衰减间隔10 dB，在接近阈值时，衰减间隔5 dB，滤波带宽100～3 000 Hz，信号放大50 000倍，观察窗为10 ms，叠加1 024次。观察高(90 dB SPL)、中(60 dB SPL)、低(20 dB SPL)强声刺激下ABR各波的出现率，依据出现率最高的波判断阈值。放大波形图，量取出现率最高波的潜伏期和幅值。

2 结果

2.1高、中、低声强刺激诱发 ABR 各波的出现率(表1)

表1 不同刺激声强下C57小鼠ABR各波的出现率(%)(n=40耳)

将表1的结果与文献[9]中列出的不同刺激声强度下小鼠各波的出现率比较可知，在高强度下，I、II、III各个波均可以出现，波IV、V出现率也较高，随着刺激声强度降低，波II、III出现率仍较高，波IV、V出现率降低，波II出现率最高。

2.2ABR反应阈的判断(图1) 图1 显示波Ⅱ最稳定，出现率最高，故以波Ⅱ刚刚出现时的刺激声强为阈值[7]。高刺激声强时波II波形较容易判断，接近阈值时，由于电压幅度接近本底噪声，放大波形图，如果在上一刺激声强下波II的潜伏期稍靠后的位置有切迹，而下一个刺激声强度无切迹则可以判定该刺激声强度为阈值。据此，本组正常C57小鼠的ABR反应阈为20±5.62 dB SPL。

2.3波Ⅱ幅值与潜伏期的量取 (图2) 幅值的判断有两种方法[10]：一种是量取波峰与基线之间的差值 (图2中A所示)，另外一种是波峰与波谷的差值(图2中B所示)。有时由于基线不稳，前一种方法很测量不准，故采用波峰与波谷幅值之间的差值，该方法可消除基线不稳带来的影响。

潜伏期的量取也有两种方法：一种方法是声音刺激开始到波Ⅱ刚要上升阶段的时间间隔(图3中A所示)，第二种是声音刺激开始到波Ⅱ峰值的时间差(图3中B所示)。为消除基线不稳带来的影响，采用后一种方法测量。

图1 C57小鼠ABR波II随刺激声强度的变化

图2 C57小鼠ABR波Ⅱ幅值的量取方法

图3 C57小鼠ABR波Ⅱ潜伏期的量取方法

2.4波Ⅱ幅值与潜伏期随声强的变化 (表2)

表2 不同强度刺激声下波Ⅱ峰-波谷幅值与潜伏期

从表2可见刺激声强度从低到高变化时，波II幅值逐渐增加，在20～70 dB SPL时增加较快。在高刺激声强度下(90 dB SPL)潜伏期较短，均值为2.71 ms，随着刺激声强度降低，潜伏期延长，在阈值附近(20 dB SPL)潜伏期为3.16 ms，与90 dB SPL强度下的潜伏期相差约0.5 ms。不同强度下引出的ABR波形曲线，Ⅰ-Ⅱ、Ⅱ-Ⅲ、Ⅲ-IV以及IV-V波间期分别为0.92±0.12、0.83± 0.17 、1.03 ±0.11和1.14±0.13 ms，均在1 ms左右。

3 讨论

3.1C57小鼠ABR检测时电极的放置位置 ABR波形分化受很多因素影响，电极插入的位置和刺激声影响尤为明显，颅顶记录到的电位较高，颅顶记录电极的插入方法是电极刺破皮肤轻轻固定于颅骨与硬脑膜之间，保证动物头与电极一起运动，这样既可到达预定深度，又可让电极不会随动物细微的颤动改变位置。但注意不要穿透颅骨，防止出血造成动物死亡。

3.2ABR波Ⅱ阈值判断以及幅值、潜伏期量取 ABR的潜伏期准确地说是指从刺激开始到刚刚开始有神经冲动，在波形图上表现为从刺激起始到波形刚上升这段时间，但由于很多时间基线不稳、波的起始点不易判断，所以选择从刺激开始到峰值的时间差作为潜伏期。本组C57小鼠ABR潜伏期为2.71±0.17～3.08±0.21 ms，与方华敏等[11]结果类似。既往研究豚鼠、大鼠ABR阈值判断多以波III为标准，然而本研究发现小鼠ABR波Ⅱ出现率最高，在较低刺激声强下仍有很高的引出率，故认为以波Ⅱ判断阈值更科学。以波Ⅱ为判断标准，正常小鼠的ABR反应阈为20±5.62 dB SPL。幅值的量取选择波峰值与各波的差值，也是为避免基线不稳的干扰。本组C57小鼠ABR波Ⅱ的幅值为6.20±2.24～1.63±0.85 μV，与Chen等[12]获得正常沙鼠幅值为2～3 μV不同，原因为声刺激诱发听性脑干反应记录到的电位为场电位，其受动物头颅大小、电极放置的位置、电极插入深度以及测量点的选取等因素的影响[13]。

3.3影响ABR波形的因素 小鼠本身也会影响ABR结果，年龄是影响ABR的一个重要因素，研究表明C57小鼠在6个月后会发生衰老[14]；小鼠听功能存在个体差异性，最好能自身前后对照。本研究实验对象为C57小鼠，其它品系小鼠的ABR是否符合该特点还有待研究。

需要指出的是ABR为场电位，其容易受到电磁场、动物麻醉状态、喇叭与测听仪器的工作状态等诸多因素的影响，因此在行ABR检测时应尽量在屏蔽良好的隔声室中进行，应尽量远离噪声环境，检测过程中要关闭隔声室中其他的电器设备；要探索安全、高效的动物麻醉方法，检测过程中要注意维持动物体温，防止由于肌肉颤抖引发肌电干扰；测听设备要定期校准，实验结束后要正确保存仪器，保证其处于正常的工作状态。

(致谢：感谢中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科李兴启教授在实验设计、数据分析，以及后期对文章修改中的大力帮助！)

4 参考文献

1 Pokidysheva E, Brigande JV, Bächinger HP, et al. Prolyl 3-hydroxylase-1 null mice exhibit hearing impairment and abnormal morphology of the middle ear bone joints[J].Matrix Biology, 2013, 32:39.

2 Kane KL, Ding D, Salvi RJ, et al. Genetic background effects on age-relatedhearing loss associated with Cdh23 variants in mice[J]. Hearing Research, 2012, 283:80.

3 Makishima T, Hochman L, Armstrong R, et al. Inner ear dysfunction in caspase-3. deficient mice[J]. Neuroscience, 2011, 12:102.

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5 朱光洁，马登滨，高下，等.特异性敲除内毛细胞肌球蛋白轻链激酶对小鼠听功能影响[J].中华耳鼻喉头颈外科杂志，2013，48：1.

6 Schoen C, Burmeister M, Lesperance MM,et al. Homolog 3 (Diap3) overexpression causes progressive hearing loss and inner hair cell defects in a transgenic mouse model of human deafness[J]. PLoS One, 2013:8: e56 520.

7 李兴启, 姜泗长, 梅世昌，等. 脑干反应(BSR)的测试方法及其正常值[J]. 中国人民解放军军医进修学院学报, 1982,3:1.

8 Akil O, Seal RP, Burke K. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy[J].Neuron,2012,75:283.

9 罗香林, 刘强和, 陈顺香, 等. 两种刺激声在快速老化痴呆小鼠ABR 测试中的比较[J].重庆医学, 2010, 39:12.

10 李兴启. 听觉诱发反应及应用[M]. 北京：人民军医出版社, 2007.126～127.

11 方敏华, 马钊恩, 孙卫文,等. Fmr1 基因敲除小鼠的ABR阈值观察[J]. 解剖学研究, 2012 34:1.

12 Chen W, Jongkamonwiwat N, Abbas L, et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors[J]. 2012,490:2,78.

13 张宝林, 王燕栖. 生理因素对ABR影响研究的进展[J]. 听力学及言语疾病杂志,1996,4:36.

14 Castillo E, Carricondol F, Bartolomé MV, et al.Presbycusis: neural degeneration and aging on the auditory receptor of C57/BL6J mice[J].Acta Otorrinolaryngol, 2006, 57: 383.