耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制及同源性研究

韦柳华

[摘要] 目的 分析柳州市4所医院耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的耐药机制及同源性，为指导临床合理用药、控制感染提供依据。 方法 69株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分离自柳州市工人医院（甲医院），中医院（乙医院）、妇幼保健院（丙医院）和柳铁中心医院（丁医院）。采用纸片扩散法及微量肉汤稀释法进行药敏试验，采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析菌株同源性，聚合酶链反应（PCR）检测β-内酰胺酶基因和OprD2基因，使用氰氯苯腙（CCCP）进行主动外排泵筛选试验。 结果 69株铜绿假单胞菌对多黏菌素B和氨基糖苷类的耐药率较低，对头孢他定、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率分别为40.6%、40.6%、44.9%，其他抗菌药物的耐药率均>50%；β-内酰胺酶基因IMP阳性率为4.3%，OprD2基因阳性率为63.8%，VIM、KPC、GIM、OXA和SPM基因均未检出；主动外排表型阳性率为82.6%。PFGE分型分为A～J共10个基因型，其中A型为主要基因型，占44.1%；4所医院均存在克隆传播，甲、乙、丙、丁医院分别以A型、H型、D型、C型克隆株传播为主，甲、乙医院有共同的B型克隆株存在，甲、丁医院有共同的A型克隆株存在。 结论 克隆株在医院内、医院间播散已成为柳州市耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分离率不断上升、菌株不断增加的主要原因，主动外排泵高表达、OprD2蛋白表达缺失和产IMP型金属酶是该菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制。

[关键词] 铜绿假单胞菌；耐药机制；同源性

[中图分类号] R378.99+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）04（b）-0004-04

[Abstract] Objective To analyze drug resistance and homology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa of four hospitals in Liuzhou city for providing the basis of the clinical rational use of drugs and controling infection. Methods 69 strains of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa were isolated from Worker′s Hospital （A Hospital），Hospital of Traditional Chinese Medicine （B Hospital）， Maternal and Child Health Hospital （C Hospital） and Liu Railway Central Hospital （D Hospital）.Drug sensitive test was conducted by by disk diffusion and broth micro dilution，the homology of bacterial strain was analyzed by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE），gene of β-lactamase and OprD2 was detected by PCR，active efflux pump screening test was conducted by CCCP. Results In 69 strains of Pseudomonas aeruginosa，drug resistance rate of polymyxin B and aminoglycoside was lower，ceftazidime，cefoperazone / shubatan and piperacillin/tazobactam was 40.6%，40.6%，44.9% respectively，other antibiotic′s resistance rate was >50%；the positive rate of β-lactamase gene IMP was 4.3% and the positive rate of OprD2 was 63.8%，strains positive for gene VIM，KPC，GIM，OXA and SPM were not detected；the positive rate of active efflux phenotype was 82.6%.There were 10 genotype by PFGE named A-J，the major A type was 44.1%；four hospitals（ A，B，C and D Hospital） all contained clone transmission and clone strain transmission of A，B，C and D Hospital was mainly type A，type H，type D，type C respectively，both A and B Hospital exsited type B clone strain，both A and D Hospital existed type A clone strain. Conclusion Clone strain spread in the hospital and among hospitals has become the main reason of the isolated rate of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa rising，and strain increasing in Liuzhou city，the main mechanism of drug resistance of Pseudomonas aeruginosa to carbapenem drugs was high expression of active efflux pump，OprD2 protein expression loss and production IMP type metal enzyme.

[Key words] Pseudomonas aeruginosa；Drug resistance mechanism；Homology

近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的广泛使用，在药物的选择压力下，耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的分离率也在不断增高[1-4]，给临床抗感染治疗带来极大的挑战。本研究对柳州市4所医院临床分离的69株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌进行耐药性、同源性及碳青霉烯类抗生素相关耐药基因和主动外排泵机制分析，以初步阐明引起医院内感染菌株的耐药机制和同源性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 69株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌均为2010年1月～2012年3月柳州市4所三级甲等医院住院患者送检标本中分离所得，同一患者多次分离到的菌株不重复计入，其中工人医院（甲医院）50株，中医院（乙医院）7株、妇幼保健院（丙医院）8株、柳铁中心医院（丁医院）4株。细菌鉴定和药敏试验的质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠埃希菌ATCC 25922，脉冲场电泳Marker所用菌株为Braenderup血清型的沙门菌H9812。

1.1.2 主要仪器 CHEF Mapper 脉冲场凝胶电泳仪和凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）、Microscan Autoscan-4微生物分析仪（西门子公司，德国）、Vitek2 Compact全自动微生物分析仪（生物梅里埃公司，法国）、ABI 7300 PCR仪（ABI，美国）。

1.1.3 主要试剂 NC31 型检测板（西门子公司，德国），GN卡和E-test试条（生物梅里埃公司，法国），限制性内切酶SpeⅠ、XbaⅠ（Promega ，美国），SeaKem Gold 脉冲场凝胶电泳琼脂糖（CAMBREX，美国），蛋白酶K（MERCK，德国），十二烷基肌氨酸钠、Tris缓冲液、EDTA、硼酸等（Sigma，美国），氰氯苯腙 CCCP（Sigma，美国），抗菌药物纸片（OXOID，英国），PCR试剂（上海英潍贸易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定和药敏试验 采用Microscan Autoscan-4和Vitek2 Compact微生物分析仪进行细菌鉴定。采用纸片扩散法（K-B法）及微量肉汤稀释法进行药敏试验，按CLSI 2012年标准[5]判断结果。

1.2.2 β-内酰胺酶基因与OprD2基因检测 采用PCR检测VIM基因、IMP基因、KPC基因、GIM基因、OXA基因、SPM基因和OprD2基因。DNA模板制备、引物序列、PCR反应体系及反应条件详见参考文献[6]。扩增产物送上海英潍贸易有限公司测序，测序结果在GenBank上经BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）比对分析，确定基因型。

1.2.3 主动外排泵筛选试验 配制水解酪蛋白（M-H）琼脂和含CCCP（终浓度70 mg/L，该浓度对外排泵有较好的抑制作用，而对细菌生长无影响）的M-H 琼脂平皿，挑取2～3个过夜培养的菌落，用生理盐水调至0.5麦氏单位，按照K-B法操作涂布菌悬液和粘贴亚胺培南E-test试条，放35℃培养24 h，观察CCCP对亚胺培南的MIC的逆转作用。当存在CCCP时亚胺培南的MIC比缺乏时相应的MIC下降至原值的1/4或更低，则判断为外排泵阳性株，提示主动外排机制存在。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳 从69株铜绿假单胞菌中筛选出34株细菌进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）。具体操作：铜绿假单胞菌经细胞裂解液和蛋白酶裂解后，用内切酶SpeⅠ过夜消化凝胶栓中的基因组DNA，然后凝胶栓嵌入1%琼脂糖凝胶，将琼脂糖凝胶放入电泳槽中电泳。电泳参数：脉冲时间6.75～35.38 s，电泳时间20 h，温度14℃，电场夹角120°，电场强度6 V/cm。沙门菌 H9812作为电泳分子量标记 Marker。然后在EB溶液中染色30 min，纯水脱色1 h，在凝胶成像系统观察并照相。所获得的图像用BioNumerics 6.6软件导入指纹图谱库，运用该软件的clustering 功能，根据条带的差异，用UPGMA法进行聚类分析。PFGE的判读按美国疾病控制和预防中心Tenover等[7]的肉眼判定标准，并结合BioNumerics软件分析的UPGMA法[8]。①无法区分：肉眼0条带不同，UPGMA法为100%相似；②紧密相关型：肉眼2～3条带不同，UPGMA法相似度为80%以上；③有可能有关：肉眼4～6条带不同，UPGMA法相似度为80%以上；④不同：肉眼≥7条带不同，UPGMA法相似度为80%以下。①、②和③被判断为有克隆相关性，可归为同一克隆，如A克隆，其中①为A1亚型，②和③分别命名为A2亚型，A3亚型。

1.3 统计学处理

使用WHONET 5.6软件对药敏结果进行分析，使用SPSS 13.0软件分析数据。

2 结果

2.1 药敏试验

多黏菌素B、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素对该菌保持较强的抗菌活性，耐药率分别为0、11.6%、20.3%、21.7%，其次为头孢他定、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦，耐药率分别为40.6%、40.6%、44.9%（表1）。

2.2 耐药基因检测

69株铜绿假单胞菌中，仅3株检测出IMP 基因，阳性率为4.3%，测序为IMP-1型金属酶基因（GenBank登录号：AB472901.2），OprD2基因缺失44株，阳性率为63.8%，其余耐药基因（VIM、KPC、GIM、OXA和SPM）均未检出。

2.3 主动外排泵筛选试验

在CCCP作用下，69株铜绿假单胞菌中有57株细菌对亚胺培南的MIC下降至原值的1/4或更低，主动外排表型阳性率为82.6%。