沙门菌属stn基因LAMP在食品卫生检验中的应用

王胜启　马艳艳　李静等

[摘要] 目的 评价LAMP在食品卫生沙门菌属检验中的应用效果。 方法 选择145份食品标本，采用LAMP方法和分离培养法进行检测，比较两种检测方法的阳性率。 结果 LAMP阳性率为12.4%，分离培养法阳性率为6.2%。两种方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。两种方法的阳性符合率为77.8%，阴性符合率为91.9%。 结论LAMP法用于食品卫生沙门菌属的检验，具有快速、方便、阳性率高等优点。

[关键词] 沙门菌属；环介导等温扩增；分离培养；食品卫生检验

[中图分类号] R155.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我国已发现的血清型有216个。传统对沙门菌的检测主要有分离培养方法，虽然准确但是程序繁琐，而免疫学方法的敏感度相对较低，PCR等敏感度和特异度均较高，但是设备要求较高，在基层不容易推广应用[2，3]。环介导等温扩增法（LAMP）是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点[4]。本研究比较环介导等温扩增法检测食品标本沙门菌属与分离培养法的一致性，探讨其在食品卫生检验中的应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

2013年6～8月选择145份食品标本，其中冷冻生肉20份，生鲜肉20份，熟肉20份，非发酵豆制品20份，速冻米面20份，生水产品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鲜榨果汁10份，生食类蔬菜5份。阳性控制菌株：肠炎沙门菌。

1.2 检测方法

1.2.1 标本前增菌 将收集到的标本取25 g，装入无菌均质袋中，拍击式均质器拍打2 min，37℃培养10 h。冷冻食品在45℃下解冻15 min。

1.2.2 分离培养法 将增菌后的145份标本取1 mL，接种于10 mL的TTB增菌液中，42℃培养24 h。另取1 mL，接种于10 mL的SC增菌液中，37℃培养24 h。分别取增菌液1环，接种于BS平板和XLD平板，37℃培养24 h。取可疑菌落3个，接种于TSI、营养琼脂平板和赖氨酸脱羧酶试验培养基，37℃培养24 h。对于生化反应初步符合沙门菌特征的，从营养琼脂平板上取可疑菌落，生理盐水制成菌悬液，在微生物鉴定系统上进行分析。如果BS平板及XLD平板上无可疑菌落，BS平板37℃继续培养24 h，如果仍无可疑菌落则为阴性。

1.2.3 LAMP检测方法 取标本前增菌液1 mL，离心，10 000 r/min，2 min，弃上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待检模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。检测145份标本DNA。反应结束后，肉眼观察反应液为绿色者为阳性，无色或者棕色者为阴性。或者采用电泳方法进行鉴定，电泳图片显示最小片段>100 bp的特征性梯状为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，计数资料采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同标本两种方法检测阳性结果

见表1。LAMP阳性率为12.4%，分离培养法阳性率为6.2%。两种方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

沙门菌病是指由各种类型沙门菌所引起的对人类、家畜及野生禽兽不同形式感染的总称。感染沙门菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒[5，6]。细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首，引起肠伤寒、肠胃炎和败血症，也可传染人类以外的其他多种动物。沙门菌通过消化道传染致病[7，8]。

环介导等温扩增技术是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新的恒温核酸扩增方法，其针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶，在等温条件下保温30～60 min，完成扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等，具有简单、快速、特异性强的特点。其灵敏度、特异性和检测范围等甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。袁发浒等[9]探讨了肠炎沙门菌的LAMP检测方法的建立，认为LAMP法可快速特异地检测出肠炎沙门菌，该方法反应灵敏度高，可用于食品中肠炎沙门菌的快速检测。黄金海等[10]探讨LAMP快速检测方法在食品中沙门菌检测中的应用，结果显示该方法仅对沙门菌产生特异性扩增，所建立的检测沙门菌方法具有较高的特异性与灵敏性，操作简单、快速，可用于沙门菌污染食品的快速检测。李雪等[11]分别采用LAMP法、PCR和国标法对市场上销售的鸡蛋蛋壳及内容物进行沙门菌的检测，LAMP和PCR的沙门菌检出率均高于国标法，而LAMP法敏感性、特异性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一种快速、敏感和高度特异性的沙门菌检测方法。田桢干等[12]探讨了LAMP技术快速检测沙门菌方法的建立及其应用，沙门菌属6种不同血清型菌株LAMP检测都呈阳性，其他4种肠道细菌均为阴性；LAMP法的灵敏度与RT-PCR方法接近，达103 CFU/mL，是胶体金检测法的100～1000倍；54株沙门菌临床分离样本实验符合率达100%。

细菌分离培养是常用的一种检测方法，但是其程序复杂，不能用于快速检测，其得出阳性结果需要7 d时间，并且细菌分离需要将两次增菌后再分离培养，其生化鉴定程序繁琐，鉴定系统昂贵，不利于在基层推广[9，10]。LAMP法对前增菌液进行核酸提取后就可以进行扩增，在60 min就可以完成扩增，在24 h内就可以检出沙门菌属，具有更加快捷的优点。并且在结果的判定中，可以肉眼观察，更方便和直观。本研究将LAMP方法与细菌分离培养方法进行比较，对145份食品进行沙门菌的检测。结果显示，两种检测方法的阳性率存在显著差异，LAMP法的阳性率显著高于细菌分离培养法，而以细胞分离培养做参照，对两种检测方法的阳性符合率和阴性符合率进行分析，显示两种方法的阳性符合率为77.8%，而两组的阴性符合率高达91.9%。

综上所述，LAMP法用于食品卫生沙门菌属的检验，具有快速、方便、阳性率高等优点，可以用于食品卫生的初步检验，对于阳性结果的可进一步通过细菌培养法进行菌株分离及鉴定分型。endprint

[摘要] 目的 评价LAMP在食品卫生沙门菌属检验中的应用效果。 方法 选择145份食品标本，采用LAMP方法和分离培养法进行检测，比较两种检测方法的阳性率。 结果 LAMP阳性率为12.4%，分离培养法阳性率为6.2%。两种方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。两种方法的阳性符合率为77.8%，阴性符合率为91.9%。 结论LAMP法用于食品卫生沙门菌属的检验，具有快速、方便、阳性率高等优点。

[关键词] 沙门菌属；环介导等温扩增；分离培养；食品卫生检验

[中图分类号] R155.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我国已发现的血清型有216个。传统对沙门菌的检测主要有分离培养方法，虽然准确但是程序繁琐，而免疫学方法的敏感度相对较低，PCR等敏感度和特异度均较高，但是设备要求较高，在基层不容易推广应用[2，3]。环介导等温扩增法（LAMP）是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点[4]。本研究比较环介导等温扩增法检测食品标本沙门菌属与分离培养法的一致性，探讨其在食品卫生检验中的应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

2013年6～8月选择145份食品标本，其中冷冻生肉20份，生鲜肉20份，熟肉20份，非发酵豆制品20份，速冻米面20份，生水产品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鲜榨果汁10份，生食类蔬菜5份。阳性控制菌株：肠炎沙门菌。

1.2 检测方法

1.2.1 标本前增菌 将收集到的标本取25 g，装入无菌均质袋中，拍击式均质器拍打2 min，37℃培养10 h。冷冻食品在45℃下解冻15 min。

1.2.2 分离培养法 将增菌后的145份标本取1 mL，接种于10 mL的TTB增菌液中，42℃培养24 h。另取1 mL，接种于10 mL的SC增菌液中，37℃培养24 h。分别取增菌液1环，接种于BS平板和XLD平板，37℃培养24 h。取可疑菌落3个，接种于TSI、营养琼脂平板和赖氨酸脱羧酶试验培养基，37℃培养24 h。对于生化反应初步符合沙门菌特征的，从营养琼脂平板上取可疑菌落，生理盐水制成菌悬液，在微生物鉴定系统上进行分析。如果BS平板及XLD平板上无可疑菌落，BS平板37℃继续培养24 h，如果仍无可疑菌落则为阴性。

1.2.3 LAMP检测方法 取标本前增菌液1 mL，离心，10 000 r/min，2 min，弃上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待检模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。检测145份标本DNA。反应结束后，肉眼观察反应液为绿色者为阳性，无色或者棕色者为阴性。或者采用电泳方法进行鉴定，电泳图片显示最小片段>100 bp的特征性梯状为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，计数资料采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同标本两种方法检测阳性结果

见表1。LAMP阳性率为12.4%，分离培养法阳性率为6.2%。两种方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

沙门菌病是指由各种类型沙门菌所引起的对人类、家畜及野生禽兽不同形式感染的总称。感染沙门菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒[5，6]。细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首，引起肠伤寒、肠胃炎和败血症，也可传染人类以外的其他多种动物。沙门菌通过消化道传染致病[7，8]。

环介导等温扩增技术是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新的恒温核酸扩增方法，其针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶，在等温条件下保温30～60 min，完成扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等，具有简单、快速、特异性强的特点。其灵敏度、特异性和检测范围等甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。袁发浒等[9]探讨了肠炎沙门菌的LAMP检测方法的建立，认为LAMP法可快速特异地检测出肠炎沙门菌，该方法反应灵敏度高，可用于食品中肠炎沙门菌的快速检测。黄金海等[10]探讨LAMP快速检测方法在食品中沙门菌检测中的应用，结果显示该方法仅对沙门菌产生特异性扩增，所建立的检测沙门菌方法具有较高的特异性与灵敏性，操作简单、快速，可用于沙门菌污染食品的快速检测。李雪等[11]分别采用LAMP法、PCR和国标法对市场上销售的鸡蛋蛋壳及内容物进行沙门菌的检测，LAMP和PCR的沙门菌检出率均高于国标法，而LAMP法敏感性、特异性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一种快速、敏感和高度特异性的沙门菌检测方法。田桢干等[12]探讨了LAMP技术快速检测沙门菌方法的建立及其应用，沙门菌属6种不同血清型菌株LAMP检测都呈阳性，其他4种肠道细菌均为阴性；LAMP法的灵敏度与RT-PCR方法接近，达103 CFU/mL，是胶体金检测法的100～1000倍；54株沙门菌临床分离样本实验符合率达100%。

细菌分离培养是常用的一种检测方法，但是其程序复杂，不能用于快速检测，其得出阳性结果需要7 d时间，并且细菌分离需要将两次增菌后再分离培养，其生化鉴定程序繁琐，鉴定系统昂贵，不利于在基层推广[9，10]。LAMP法对前增菌液进行核酸提取后就可以进行扩增，在60 min就可以完成扩增，在24 h内就可以检出沙门菌属，具有更加快捷的优点。并且在结果的判定中，可以肉眼观察，更方便和直观。本研究将LAMP方法与细菌分离培养方法进行比较，对145份食品进行沙门菌的检测。结果显示，两种检测方法的阳性率存在显著差异，LAMP法的阳性率显著高于细菌分离培养法，而以细胞分离培养做参照，对两种检测方法的阳性符合率和阴性符合率进行分析，显示两种方法的阳性符合率为77.8%，而两组的阴性符合率高达91.9%。

综上所述，LAMP法用于食品卫生沙门菌属的检验，具有快速、方便、阳性率高等优点，可以用于食品卫生的初步检验，对于阳性结果的可进一步通过细菌培养法进行菌株分离及鉴定分型。endprint

[摘要] 目的 评价LAMP在食品卫生沙门菌属检验中的应用效果。 方法 选择145份食品标本，采用LAMP方法和分离培养法进行检测，比较两种检测方法的阳性率。 结果 LAMP阳性率为12.4%，分离培养法阳性率为6.2%。两种方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。两种方法的阳性符合率为77.8%，阴性符合率为91.9%。 结论LAMP法用于食品卫生沙门菌属的检验，具有快速、方便、阳性率高等优点。

[关键词] 沙门菌属；环介导等温扩增；分离培养；食品卫生检验

[中图分类号] R155.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）12-0114-02

[Abstract] Objective To evaluate application of salmonella LAMP in sanitary inspection of foodstuffs. Methods Selected 145 food samples were detected by LAMP and separated cultivation method. Positive rate was compared. Results Positive rate of LAMP was 12.4%， and that of separated cultivation method was 6.2%. There was significant difference （P < 0.05）. Positive coincidence rate of two methods was 77.8%， and negative coincidence rate was 91.9%. Conclusion Salmonella LAMP for sanitary inspection of foodstuffs shows rapid， convenience， high positive rate.

[Key words] Salmonella； LAMP； Sanitary inspection of foodstuffs

在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首[1]。我国已发现的血清型有216个。传统对沙门菌的检测主要有分离培养方法，虽然准确但是程序繁琐，而免疫学方法的敏感度相对较低，PCR等敏感度和特异度均较高，但是设备要求较高，在基层不容易推广应用[2，3]。环介导等温扩增法（LAMP）是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点[4]。本研究比较环介导等温扩增法检测食品标本沙门菌属与分离培养法的一致性，探讨其在食品卫生检验中的应用价值，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

2013年6～8月选择145份食品标本，其中冷冻生肉20份，生鲜肉20份，熟肉20份，非发酵豆制品20份，速冻米面20份，生水产品10份，冰激凌10份，沙拉10份，鲜榨果汁10份，生食类蔬菜5份。阳性控制菌株：肠炎沙门菌。

1.2 检测方法

1.2.1 标本前增菌 将收集到的标本取25 g，装入无菌均质袋中，拍击式均质器拍打2 min，37℃培养10 h。冷冻食品在45℃下解冻15 min。

1.2.2 分离培养法 将增菌后的145份标本取1 mL，接种于10 mL的TTB增菌液中，42℃培养24 h。另取1 mL，接种于10 mL的SC增菌液中，37℃培养24 h。分别取增菌液1环，接种于BS平板和XLD平板，37℃培养24 h。取可疑菌落3个，接种于TSI、营养琼脂平板和赖氨酸脱羧酶试验培养基，37℃培养24 h。对于生化反应初步符合沙门菌特征的，从营养琼脂平板上取可疑菌落，生理盐水制成菌悬液，在微生物鉴定系统上进行分析。如果BS平板及XLD平板上无可疑菌落，BS平板37℃继续培养24 h，如果仍无可疑菌落则为阴性。

1.2.3 LAMP检测方法 取标本前增菌液1 mL，离心，10 000 r/min，2 min，弃上清，提取核酸，另取1 μL上清液，制作待检模板DNA。引物由百壹星辰（北京）生物科技有限公司提供。检测145份标本DNA。反应结束后，肉眼观察反应液为绿色者为阳性，无色或者棕色者为阴性。或者采用电泳方法进行鉴定，电泳图片显示最小片段>100 bp的特征性梯状为阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，计数资料采用χ2检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同标本两种方法检测阳性结果

见表1。LAMP阳性率为12.4%，分离培养法阳性率为6.2%。两种方法比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

沙门菌病是指由各种类型沙门菌所引起的对人类、家畜及野生禽兽不同形式感染的总称。感染沙门菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒[5，6]。细菌性食物中毒中，沙门菌引起的食物中毒常列榜首，引起肠伤寒、肠胃炎和败血症，也可传染人类以外的其他多种动物。沙门菌通过消化道传染致病[7，8]。

环介导等温扩增技术是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新的恒温核酸扩增方法，其针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶，在等温条件下保温30～60 min，完成扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等，具有简单、快速、特异性强的特点。其灵敏度、特异性和检测范围等甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。袁发浒等[9]探讨了肠炎沙门菌的LAMP检测方法的建立，认为LAMP法可快速特异地检测出肠炎沙门菌，该方法反应灵敏度高，可用于食品中肠炎沙门菌的快速检测。黄金海等[10]探讨LAMP快速检测方法在食品中沙门菌检测中的应用，结果显示该方法仅对沙门菌产生特异性扩增，所建立的检测沙门菌方法具有较高的特异性与灵敏性，操作简单、快速，可用于沙门菌污染食品的快速检测。李雪等[11]分别采用LAMP法、PCR和国标法对市场上销售的鸡蛋蛋壳及内容物进行沙门菌的检测，LAMP和PCR的沙门菌检出率均高于国标法，而LAMP法敏感性、特异性和符合率也均高于PCR法，因此，LAMP是一种快速、敏感和高度特异性的沙门菌检测方法。田桢干等[12]探讨了LAMP技术快速检测沙门菌方法的建立及其应用，沙门菌属6种不同血清型菌株LAMP检测都呈阳性，其他4种肠道细菌均为阴性；LAMP法的灵敏度与RT-PCR方法接近，达103 CFU/mL，是胶体金检测法的100～1000倍；54株沙门菌临床分离样本实验符合率达100%。

细菌分离培养是常用的一种检测方法，但是其程序复杂，不能用于快速检测，其得出阳性结果需要7 d时间，并且细菌分离需要将两次增菌后再分离培养，其生化鉴定程序繁琐，鉴定系统昂贵，不利于在基层推广[9，10]。LAMP法对前增菌液进行核酸提取后就可以进行扩增，在60 min就可以完成扩增，在24 h内就可以检出沙门菌属，具有更加快捷的优点。并且在结果的判定中，可以肉眼观察，更方便和直观。本研究将LAMP方法与细菌分离培养方法进行比较，对145份食品进行沙门菌的检测。结果显示，两种检测方法的阳性率存在显著差异，LAMP法的阳性率显著高于细菌分离培养法，而以细胞分离培养做参照，对两种检测方法的阳性符合率和阴性符合率进行分析，显示两种方法的阳性符合率为77.8%，而两组的阴性符合率高达91.9%。

综上所述，LAMP法用于食品卫生沙门菌属的检验，具有快速、方便、阳性率高等优点，可以用于食品卫生的初步检验，对于阳性结果的可进一步通过细菌培养法进行菌株分离及鉴定分型。endprint