热敏脂质体抗肿瘤药物改善肝肿瘤热消融疗效的动物实验

王凇，翁勰，龚伟，李荣杰，王延杰，梅兴国，杨薇

·实验研究Experimental research·

热敏脂质体抗肿瘤药物改善肝肿瘤热消融疗效的动物实验

王凇，翁勰，龚伟，李荣杰，王延杰，梅兴国，杨薇

目的探讨射频消融（RFA）联合抗肿瘤药物热敏脂质体长春瑞滨（TL-VIN）治疗肿瘤的病理机制，分析联合治疗对改善实验动物长期生存率的影响。方法采用皮下种植H 22肝腺癌模型的国产雄性ICR荷瘤小鼠入组本研究。分3阶段分别进行肿瘤坏死面积测量，分析治疗后肿瘤病理表现；测量瘤内药物浓度；以及对不同组治疗后生存率的比较。第1阶段，选取40只荷瘤小鼠随机接受5组不同治疗方案（每组8只）治疗后24 h取肿瘤切片，分别测量坏死面积，确认最佳热敏脂质体药物浓度；以及分析各组肿瘤治疗后的病理表现。第2阶段，选取13只荷瘤小鼠治疗后0.5 h取出肿瘤组织，测量瘤内药物浓度。第3阶段，选取32只荷瘤小鼠随机进入4组（每组8只），治疗后随访90 d绘制肿瘤生长曲线，比较各组小鼠肿瘤治疗后的生存率。结果与单纯RFA组相比，TL-VIN显著增加RFA对肝肿瘤的破坏范围（P＜0.01），而游离长春瑞滨（free-VIN）联合RFA的肿瘤坏死面积与单纯RFA相似（P＞0.05）。TLVIN药物浓度在10mg/kg时可获得显著优于free-VIN的效果，为（341.8±65.4）mm2比（225.3±25.4）mm2（P＜0.01）。单纯RFA组消融区边缘坏死及变性细胞与正常肝组织交叉，界限不清；而联合治疗组消融区边缘变性细胞减少，与正常组织分界更清晰。RFA联合治疗中，TL-VIN在肿瘤内沉积效果显著增加，浓度约为free-VIN的10倍，为（1 156.5±158.3）ng/m l比（194.5±52.3）ng/m l（P=0.005）。TL-VIN+RFA平均终点生存期最长，达（37.6±20.1）d，优于free-VIN+RFA（23.3±1.2）d及单独RFA组（23.4±5.0）d，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论应用新型药物载体——热敏脂质体长春瑞滨可以在加热状态下大量释放药物，提高瘤内浓度，增强与热消融协同作用，扩大坏死范围，并最终改善生存期，为RFA治疗提供了有效的辅助手段。

射频消融；肝肿瘤；热敏脂质体；抗肿瘤药物；联合治疗

如何克服射频消融（RFA）治疗肿瘤的局限性成为目前研究的热点问题。RFA联合脂质体纳米技术递送化疗药物的治疗模式引起了极大的关注［1］。与传统脂质体药物相比，热敏感脂质体在热消融中辅助给药时，使药物在加热的肿瘤脉管中立即释放，提高局部药物浓度［2］。本研究应用热敏脂质体长春瑞滨（thermosensitive liposomal vinorelbine，TL-VIN）与RFA联合治疗荷瘤小鼠，以期评价RFA联合TL-VIN/free-VIN的各种治疗方案对肿瘤坏死面积的影响及病理基础；定量检测RFA与热敏脂质体药物联合应用对瘤内药物浓度改变；联合治疗对小鼠长期生存率的改善。本研究获北京大学肿瘤医院伦理委员会的批准。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料

健康、雄性的国产ICR小鼠85只，体重（28± 2）g，购自维通利华实验动物技术有限公司。

消融仪器为CC-1-220型单极RFA仪（Valleylab公司，泰科医疗，美国），发生器频率480 kHz，最大输出功率40W，21 G Cool-tip射频电极针，长度15 cm，尖端裸露0.7 cm。

重酒石酸长春瑞滨制剂（双鹭药业股份有限公司），二棕榈酰胆碱（DPPC）、monopalmitoylphosphatidylcholine（MPPC）和1，2-distearyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-［methoxy（polyethyl-eneglycol）-2000］（DSPE-mPEG2000）均购于美国Lipids公司，Agilent 6410三重四极质谱（ESI），Agilent 1200高效液相色谱系统（安捷伦科技，圣克拉拉，加利福尼亚，美国）和Agela C18反相色谱柱（Agela Venusil XBPC18，2.1×50 mm，3μm，博纳艾杰尔科技公司，波士顿）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及动物分组

1.2.1.1 动物模型制作:将冻存的H22腹水瘤细胞取出，37℃条件下复苏后予ICR小鼠腋窝皮下注射0.3～0.4m l，7 d后长成直径约0.9 cm的瘤块。切取瘤块周边生长旺盛的鱼肉样组织，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm小块植瘤于150只小鼠腹部皮下。肿块种植后21～28 d均长成直径为1.0～1.2 cm的肿瘤。

1.2.1.2 动物分组:第1段取40只（共40个肿瘤）随机接受5组不同治疗方案（每组均8只），即:①单纯RFA组；②酒石酸长春瑞滨联合RFA组（free-VIN+RFA）；③，④，⑤组:TL-VIN+RFA治疗组，又以TL-VIN药物浓度分别为5、10和20 mg/kg。第2阶段取13只，10只为双瘤（共计20个肿瘤）的荷瘤小鼠，平均分为TL-VIN、TL-VIN联合RFA组与free-VIN、free-VIN联合RFA组（每组5个肿瘤）；余下3只为单瘤（共计3个肿瘤）荷瘤小鼠未接受任何治疗，作为阴性对照组。第3阶段取32只（共32个肿瘤）随机分为4个治疗组（每组均8只）:①单独RFA组；②free-VIN联合RFA组；③TL-Vin联合RFA组；④荷瘤对照组。

1.2.2 热敏脂质体长春瑞滨的制备和应用参考相关文献制备TL-VIN［3］。

在动物实验中，将制备好的TL-VIN或free-VIN经尾静脉缓慢注射，浓度为均1mg/ml，剂量为0.125，0.25和0.5 ml。

1.2.3 RFA治疗方法荷瘤小鼠按45 mg/kg腹腔注射5%戊巴比妥钠，麻醉后腹部及背部脱毛，使用21 G射频电极针，电极针尖垂直插入肿瘤中心，确保针尖温度保持（70±2）℃，消融时间5 min。经尾静脉注射药物治疗的小鼠在注射30 min后进行RFA治疗。

1.2.4 取材方法第1阶段所有小鼠在治疗后24 h处死，分离取出肿瘤，层厚5 mm切片，4%甲醛固定，进一步行病理染色分析。第2阶段所有小鼠在治疗后0.5 h处死，同法取材后。-80℃冰箱保藏，行药物浓度分析。

1.2.5 瘤内长春瑞滨的浓度测定使用Agilent 6410三重四极质谱（ESI）和Agilent 1200高效液相色谱系统对样品进行LC-MS/MS分析。使用反相C18色谱柱（AgelaVenusil XBP C18，2.1×50 mm，3μm，博纳艾杰尔科技公司，波士顿）对长春瑞滨和长春新碱（内标）进行分离，流动相为甲醇、含有醋酸铵的1%乙腈（80∶20，V/V）；流速0.3 m l/min；进样量5μl。

1.2.6 肿瘤坏死面积测量及病理分析选择包含肿瘤最大坏死范围的切片行TTC染色。将标本温育在37℃环境下TTC（2%）溶液中15～20 min，直到观察肿瘤标本未坏死区域呈红色。TTC断面最大的未染色区（白色）为坏死面积，可以用卡尺测量2个独立垂直尺寸而得到，坏死面积计算公式:面积=［（长径+宽径）/2］2×3.14。进行病理组织分析的肿瘤标本用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，进行病理HE染色。显微镜下观察不同治疗后肿瘤组织的病理结构改变。

1.2.7 生存期分析荷瘤小鼠肿瘤生长至1～1.2 cm，超声检查无明显坏死的肿瘤进行治疗，治疗后每2～3 d游标卡尺测量肿瘤大小，并描绘肿瘤生长曲线。以肿瘤最大径达30 mm或生存达到90 d为终点，次要指标为肿瘤生长的局部控制（即腹壁上无可见的肿瘤）。应用Kaplan-Meier法计算动物终点生存率。

1.3 统计学分析

计量数据以均值±标准差表示。计量资料比较采用Student-t检验进行。采用单因素方差分析（方差或协方差分析）对各组差异显著性进行评估。方差分析的意义由F检验证实。P＜0.05为差异有统计学意义。采用Kaplan-Meier法和Log rank检验进行生存终点分析。使用SPSS11统计分析软件进行统计。

2 结果

2.1 第1阶段:不同治疗方案对肿瘤坏死面积的影响及病理表现

TTC染色结果显示，单独RFA组肿瘤坏死范围与free-VIN组之间无明显差异，分别为（157.5± 51.5）mm2和（255.3±25.4）mm2（P＞0.05）。当TLVIN的浓度从5 mg/kg提高至20 mg/kg，肿瘤坏死范围存在剂量依赖的影响。TL-VIN（浓度5 mg/kg）组与单独RFA组相比，肿瘤坏死面积增加，为（258.3± 45.1）mm2和（157.5±51.5）mm2（P=0.026），但与free-VIN组相比，差异无统计学意义，各为（258.3± 45.1）mm2和（225.3±25.4）mm2（P＞0.05）。TL-VIN（浓度10mg/kg）组与单独RFA组及free-VIN组相比，均增加了肿瘤的坏死面积，为（341.8±65.4）mm2和（157.5±51.5）mm2或（225.3±25.4）mm2（P= 0.001和P=0.007）。TL-VIN（浓度20 mg/kg）组与其他各组相比导致肿瘤的坏死面积更大，为（425.4± 53.4）mm2，但与TL-VIN（浓度10mg/kg）组相比差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。由于TL-Vin联合RFA组中两只荷瘤小鼠在给予在20 mg/kg浓度条件下治疗后死亡，因此选择10 mg/kg为最佳浓度，进行后期试验。

表1 各组肿瘤坏死范围比较（曾±泽）

HE染色结果显示，光镜下可见消融区内部凝固性坏死，部分边缘可见不可逆的细胞损伤和细胞变性混合。高倍镜下进行观察，边缘处可见参差不齐的活性细胞岛。与此相反，TL-VIN+RFA组的标本可观察到较大的肿瘤凝固性坏死区域，同时坏死区域周边组织边界清晰，未观察到明显渐变区（图1）。

图1 肿瘤凝固坏死边缘的病理表现（HE染色）

2.2 第2阶段:定量检测瘤内药物浓度

TL-Vin组与free-Vin组相比，瘤内药物浓度明显的增加，为（194.5±72.3）ng/ml和（74.7±10.5）ng/ m l，P=0.025。free-VIN组与free-VIN联合RFA组比较，瘤内的药物浓度之间无明显差异，为（74.7± 10.5）ng/ml和（95.5±26.5）ng/ml，P＞0.05；而TLVin联合RFA组与TL-VIN组相比，瘤内药物的浓度显著增加，为（1156.5±158.3）ng/m l和（194.5± 52.3）ng/m l，P=0.005。与free-VIN联合/不联合RFA治疗相比，TL-Vin联合RFA组瘤内长春瑞滨药物浓度增加约10倍（图2）。

图2 瘤内长春瑞滨摄取浓度比较

2.3 第3阶段:联合治疗对动物长期生存率的影响

单纯RF组及free-VIN联合RFA组荷瘤小鼠的平均生存期分别为（23.4±5.0）d和（23.3± 1.2）d，均高于对照组（17.5±2.5）d，差异有统计学意义（P＜0.05）。TL-VIN联合RFA组优于单纯RFA组，为（37.6±20.1）d和（23.4±5.0）d，P=0.018及free-VIN+RFA组，为（37.6±20.1）d和（23.3± 1.2）d（P=0.024），差异具有统计学意义（图3）。而单纯RFA组与free-VIN联合RFA组之间的平均生存期差异无统计学意义，为（23.4±5.0）d和（23.3± 1.2）d（P＞0.05）。在TL-VIN+RFA组中有1个肿瘤得到局部控制，长期无瘤生存，但其他组均没有肿瘤得到长期局部控制（图4）。

图3 H22肿瘤治疗后终点生存率比较

图4 不同的治疗方法后大体肿瘤的局部控制与转归

3 讨论

RFA治疗小肝癌的疗效不断提高，已经广泛被接受为治疗小肝癌的重要手段。但有文献报道，对于直径＞3 cm的肿瘤，在消融重叠区仍可能有肿瘤细胞存活［4］。近年来，多有报道常规脂质体化疗药如阿霉素可有效提高热消融肿瘤坏死范围及动物生存期［5-6］。最近，随着药物传递体系的进一步发展，新型热敏脂质体药物可能成为RFA联合治疗的最佳选择。这种新型药物载体是否能被热消融加速药物是否，形成提高局部浓度并提高疗效，是本研究的重点［7］。

长春瑞滨是长春碱半合成衍生物，为广谱抗肿瘤药物，广泛应用于实体肿瘤的治疗。热敏脂质体主要通过改变温度进而改变脂质双层的磷脂组成，从而在靶器官释放药物达到靶向治疗的目的，具有明确的热靶向性。将长春瑞滨制备成TL-VIN，并结合病变部位加热（热消融）来实现药物的靶向投递和在靶部位快速释药，有助增强其抗肿瘤的治疗效果、降低不良反应［8］。

本研究表明，TL-VIN联合RFA治疗肿瘤坏死面积明显增加，长期观察具有明显的抑瘤作用，其抑瘤作用明显优于free-VIN联合RFA组和单纯RFA组。其原因可能是TL-VIN具有热靶向性；同时加热本身就可以使肿瘤对化疗药物更加敏感，有利于阻止肿瘤细胞DNA的自我修复［9］。同时本研究也显示脂质体长春瑞滨随着浓度的提高（5 mg/kg至20 mg/kg），肿瘤坏死范围存在剂量依赖的影响，而最终浓度需考虑疗效与不良反应的平衡，本研究选择10mg/kg为最佳浓度。

测瘤体内药物浓度，TL-VIN组比free-VIN组和free-VIN联合RFA组瘤内药物浓度增加了10倍以上。分析结果证实了加热治疗可提高肿瘤对TL-VIN的敏感性和靶向性。

本研究观察到相比单纯RFA、TL-VIN联合RFA组的标本显示较大的无活性的凝固性坏死区域，边界清晰，肿瘤坏死面积也明显增加。这提示在RFA治疗中，如果同时给予热敏脂质体化疗药物，药物可以在坏死区的周围浓聚，使该区域的肿瘤细胞得以杀死，从而可扩大RFA的治疗范围，减少肿瘤的残存和复发［10］。

本研究证实单纯RFA和free-VIN联合RFA不能有效控制肿瘤，治疗后肿瘤依然生长。只有RFA联合TL-VIN具有很好的生存获益。有文献报道，局部加热可诱导肿瘤细胞发生凋亡，同时也使热敏脂质体膜的流动性增大，这种结构的变化导致脂质体的通透性发生改变，脂质体内部包封的药物借助于跨膜浓度梯度而大量扩散到靶器官中，提高了肿瘤细胞对抗肿瘤药物的摄取，使药物直接进入细胞内发挥作用，从而达到局部化疗的作用［11］。保持了细胞内较高的药物浓度并降低了全身不良反应。

本实验的不足是实验本身仅限于小鼠肿瘤模型，未在更多种类肿瘤模型中进行比较，同时也未能克服肿瘤生长中自发坏死对疗效的观察影响。因此在临床应用前，需要在更多的肿瘤模型中进一步证实，同时也需要严格的临床试验评价。

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Using thermosensitive chemotherapy agent to im prove the effect of radiofrequency ablation for liver tum ors：an animal experim ent

WANG Song，WENG Xie，GONG Wei，LEE Jung-chieh，WANG Yan- jie，MEIXing-guo，YANGWei.Key laboratory of Carcinogenesis and Translational Research（Ministry of Education），Department of Ultrasound，Peking University Cancer Hospital&Institute，Beijing 100142，China

YANG Wei，E-mail:weiwei02032001@gmail.com；MEI Xing-guo，E-mail: newdds@126.com

ObjectiveTo investigate the pathologic mechanism of radiofrequency ablation（RFA）combined with intravenous infusion of thermosensitive liposome encapsulated vinorelbine（TL-Vin）in treating liver tumors，and to analyze the effect of combination therapy on the long-term survival rate.MethodsH22 liver adenocarcinoma tissue was subcutaneously implanted into ICR mice to establish the animal models.At the first experimental period，40mice were random ly and equally divided into 5 groups to

ifferent therapeutic scheme（using different TL-Vin concentrations）.Twenty-four hours after the treatment the tumor specimens were collected，the necrotic areas were measured separately，and the optimal TL-Vin concentration was determined.At the second experimental period，13 mice were random ly selected to receive treatment.Half an hour after the treatment the tumor tissueswere collected and the TL-Vin concentration within the tumor was determined.At the third experimental period，32mice were randomly and equally divided into 4 groups，and 90 days after treatment the tumor growth curve was drawn.The survival rate was compared between each other of the groups.ResultsCompared with pure RFA group，TL-Vin+RFA significantly increased tumor coagulation extent（P＜0.01）.But free-VIN+RFA had similar tumor necrotic extent as that produced by RFA alone（P＞0.05）.Tumor coagulation area in TL-Vin+RFA group was bigger than that in free-VIN+RFA group at the concentration of 10 mg/kg［（341.8±65.4）mm2vs（225.3±25.4）mm2，P＜0.01］.In TL-Vin group the coagulationmargin was clear.Themean intratumoral Vinorelbine accumulation in TL-Vin+RFA group was 10 folds of that in free-Vin group［（1 156.5±158.3）ng/m l vs（194.5±52.3）ng/m l，P=0.005］.TL-Vin+ RFA had better survival result than thatof RFA alone（37.6±20.1 days vs.23.4±5.0 days，P=0.015），as well as than that of free-Vin+RFA［（37.6±20.1）days vs（23.3±1.2）days，P=0.016］.ConclusionThermosensitive liposomal chemotherapies（Vinorelbine）can be selectively delivered at the edge of RFA coagulation area and thus effectively increase RFA-induced tumor coagulation and prolong the end-point survival in experimentalmice.（J Intervent Radiol，2014，23:506-510）

radiofrequency ablation；liver tumor；thermosensitive liposome；antineoplastic drug；combination therapy

R735.7

B

1008-794X（2014）-06-0506-05

2014-02-24）

（本文编辑:俞瑞纲）

10.3969/j.issn.1008-794X.2014.06.012

国家自然科学青年基金（81101745）；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划（2013-3-086）

100142北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所超声科，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室（王凇、翁勰、李荣杰、王延杰、杨薇）；南方医科大学南方医院感染科暨肝病中心（翁勰）；中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所（龚伟、梅兴国）

杨薇E-mail:weiwei02032001@gmail.com；梅兴国E-mail:newdds@126.com