柳树DNA提取改良方法研究

郑纪伟，孙 冲，周 洁，何开跃，何旭东*

（1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153；2.南京林业大学，江苏 南京 210037）

柳树DNA提取改良方法研究

郑纪伟1，2，孙 冲1，2，周 洁1，何开跃2，何旭东1*

（1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153；2.南京林业大学，江苏 南京 210037）

高质量的DNA是进行林木分子生物学研究的基础与关键。该研究利用改良的CTAB法提取垂柳基因组DNA，并与常规CTAB法、CTAB－硅珠裂解法、SDS法和试剂盒法进行了比较。琼脂糖凝胶电泳检测显示，改良CTAB法提取的DNA浓度和纯度较高，质量优于其他4种提取方法。同时利用改良CTAB法提取了柳树16个自然种及杂交种基因组DNA，并经SSR－PCR扩增反应验证，表明改良CTAB法可作为一种柳树基因组DNA提取的通用方法。

柳树；DNA提取；改良CTAB法

柳树属于杨柳科（Salicaceae），是柳属（Salix）和钻天柳属（Chosenia）的通称。通常所说的柳树主要是指柳属包括的所有树种。目前全世界共有520种以上，我国有257种、122个变种，大多数属于灌木（190种以上）。作为发叶早、落叶晚的阔叶树之一，柳树自古以来就是重要的园林造景绿化树种［1］；柳树生长快，是平原地区重要的速生用材林树种，具有较高的生态和经济价值［2］；柳树光能利用率高、适应性强、栽培和更新容易，被国际上广泛应用于能源林建设，目前已经成为温带和亚热带地区最重要的能源树种［3］。由于柳树基因组不大，生长迅速且易于无性繁殖，亦可作为遗传学和基因组学研究的模式树种［4］。

DNA提取是林木分子生物学研究的基础。利用高效快速的提取方法获得高质量的DNA是进行柳树分子标记开发、种质鉴定、遗传多样性分析及QTL定位的关键所在。尽管前期已有单个柳树树种DNA提取方法的报道，如利用CTAB法和试剂盒法对蒿柳［5］、白柳［6］和爆竹柳［6］等进行DNA提取，然而柳树种类繁多，不同个体之间存在较大差异，在实际操作过程中发现已报道的柳树DNA提取方法对某些柳树树种并不适宜。本研究将对原有提取方法进行优化改良，并与CTAB法、CTAB-硅珠裂解法、SDS法和试剂盒法进行比较，并利用柳树多个自然种及杂交种进行检测，以期找到一种适合柳树基因组DNA提取的通用方法，为柳树分子生物学的后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

5种提取方法对比材料为垂柳，采集地为江苏省南京市玄武湖公园。柳树多树种提取材料为8个乔木柳和8个灌木柳。乔木柳为钻天柳、腺柳、旱柳、朝鲜柳、黑柳、白柳、苏柳172和苏柳795，灌木柳为欧洲红皮柳、蒿柳、苏柳52-2、黄花柳、绵毛柳、苏柳2345、杞柳和簸箕柳（见表1）。采集地点为江苏省林业科学研究院种质资源圃内。采集当年生幼嫩的叶片，于－70℃超低温冰箱中保存备用。

表1 16个柳树自然种及杂交种

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取方法 CTAB法参照文献［7］；CTAB硅珠-裂解法参照文献［8］；SDS法参考文献［9］；试剂盒法采用QIAGEN的植物基因组DNA提取试剂盒（DP305），按操作说明进行；改良CTAB法，即在CTAB法的基础上，增加氯仿-异戊醇的抽提次数，同时利用硅珠悬浮液与核酸结合，并用漂洗液对硅珠核酸复合物进行漂洗去污。具体步骤如下：

①称取新鲜叶样1.2 g左右，去中脉，放入预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨至粉末状，迅速将样品转移至10 mL离心管中；

②向离心管中加入4 mL 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀后65℃水浴45 min左右，每10 min上下颠倒混匀1次；

③取出样品管，4℃下12 000 r／min（16 000× g）离心10 min，取上清液；

④加入等体积氯仿∶异戊醇（体积比24∶1）摇匀，4℃下12 000 r／min（16 000×g）离心10 min，取上清液，重复3次；

⑤向上清液中加入－20℃冷藏的、等体积的异丙醇，轻轻晃动混匀，静置过夜；

⑥加入400 μL硅珠悬浮液，充分混匀静置10 min，4℃下12 000 r／min（16 000×g）离心5 min；

⑦弃上清，向沉淀中加入1 mL异硫氰酸胍漂洗液，用75%和95%酒精各洗涤1次，自然条件下在通风厨中风干沉淀物；

⑧加入1×TE 300 μL，沉淀浸泡5～10 min，过程中弹动或振荡以充分溶解DNA；

⑨14 000 r／min（22 000×g）离心5 min，取上清液，将溶液转入1.5 mL离心管，－80℃长期保存备用。

1.2.2 DNA质量的检测 取2 μL的DNA提取液和4 μL的溴酚蓝混合之后进行1%琼脂糖凝胶电泳，通过Bio-Rad凝胶成像系统进行拍照。

1.2.3 SSR-PCR扩增及电泳检测 SSR-PCR反应体系、PCR程序及扩增产物电泳检测参考文献［10］。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA不同提取方法比较

利用CTAB硅珠-裂解法、CTAB法、改良CTAB法、QIAGEN试剂盒法和SDS法分别提取垂柳基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。5种提取方法均能得到完整的DNA条带，其中第1种CTAB硅珠-裂解法得到的条带较淡，说明DNA浓度较低；第2种CTAB法得到的条带存在明显的拖尾现象，说明在提取过程中DNA发生了降解，且可能存在RNA的污染；第4种QIAGEN试剂盒法在点样孔有一定亮度，说明DNA样品中存在蛋白质及多糖等杂质，轻微拖尾现象说明DNA发生了部分降解；第5种SDS法得到的DNA与第1种方法类似，条带较淡，说明DNA浓度较低；而第3种改良CTAB法得到的电泳条带清晰、整齐、单一明亮，无拖尾且点样孔无发亮现象，说明DNA浓度较高、质量较纯，无蛋白质、多糖杂质残留，且无RNA污染。可见这5种方法中改良CTAB法提取的效果最好，SDS法及CTAB硅珠－裂解法次之，CTAB法及QIAGEN试剂盒法效果最差。

2.2 柳树多树种DNA提取

利用改良CTAB法提取8个乔木柳和8个灌木柳不同自然种及杂交种的基因组DNA，其电泳检测结果如图2所示。在16个柳树自然种及杂交种中均得到了单一、明亮的DNA条带，且无杂质污染，说明改良CTAB法可作为一种适合柳树基因组DNA提取的通用方法。

图1 5种不同DNA提取方法电泳结果对比

图2 16个柳树品种DNA的琼脂糖电泳检测

2.3 SSR－PCR扩增结果

以改良CTAB法提取的16个柳树自然种及杂交种基因组DNA为模板，并选取一对垂柳CLeSSR013引物进行SSR-PCR反应，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测结果见图3。由图3可见，16个扩增产物均得到了单一且明亮的条带，无杂带且目的片段大小均在100～500 bp，进一步说明改良CTAB法提取的柳树基因组DNA能很好的满足PCR扩增要求。

图3 垂柳CLeSSR013引物在16个种及杂交种间的PCR扩增电泳检测

3 结论与讨论

基因组DNA的提取是林木分子生物学研究的基础，也是必需环节。林木因其生长周期较长，次生代谢产物含量较高，蛋白质、多糖、酚类等物质的集聚给DNA提取增加了难度。柳树种类繁多，个体差异较大，提取材料的来源、部位、形态等外在性质和化学成分、组织结构等内在特点的差异，严重影响DNA提取的效果。因此，宜选用当年生幼嫩的叶片作为提取材料，且在取样后应及时放入超低温冰箱冷冻保存，以防止材料氧化褐变造成DNA降解。

在提取过程中，氯仿－异戊醇的抽提有利于去除蛋白质等杂质，但抽提次数会影响DNA的得率［11］。抽提次数过多，会损失部分DNA；抽提次数过少，蛋白质等杂质不易去除。本研究经反复多次试验，确定抽提3次时效果最佳。同时为了更好地降低多糖及多酚等杂质干扰，本试验结合硅珠吸附法加入硅珠悬浮液并用异硫氰酸胍漂洗液进行洗涤，得到了质量较纯的DNA。

综上所述，改良CTAB法提取的垂柳DNA浓度及纯度均优于其他4种提取方法，且适用于柳树其他树种基因组DNA的提取，并能很好地满足后续PCR实验的要求，可作为一种柳树基因组DNA提取的通用方法。

［1］ 施士争.柳树的园林应用类型与改良［J］.西北林学院学报，2008，23（4）：200-204.

［2］ 涂忠虞.柳树育种与栽培［M］.南京：江苏科学技术出版社，1982：7.

［3］ Volka T A，Abrahamson L P，Nowaka C A，et a1.The development of short-rotation willow in the northeastern United States for bioenergy and bioproducts，agroforestry and phyto-remediation［J］.Biomass and Bioenergy，2006，30（8／9）：715-727.

［4］ Hanley S，Mallott M，Karp A.Alignment of aSalixlinkage map to thePopulus genomic sequence reveals macrosynteny between willow and poplar genomes［J］.Tree Genetics and Genomes，2006，3（1）：35-48.

［5］ Alstrom-Rapaport C，Lascoux M，Wang Y C，et al.Identification of a RAPD marker linked to sex determination in the basket willow（Salix viminalisL.）［J］.Journal of Heredity，1998，89（1）：44-49.

［6］ Triest L，De Greef B，De Bondt R，et al.RAPD of controlled crosses and clones from the field suggests that hybrids are rare in theSalix alba-Salix fragiliscomplex［J］.Heredity，2000，84（5）：555-563.

［7］ 何旭东.桉树杂种优势及其分子标记辅助选择育种［D］.南京：南京林业大学，2010：57.

［8］ 张 博，张 露，诸葛强，等.一种高效的树木总DNA提取方法［J］.南京林业大学学报，2004，28（1）：13-16.

［9］ 单 志，吴宏亮，陈 伟，等.改良SDS法提取多种植物基因组DNA研究［J］.广东农业科学，2011（8）：113-115.

［10］郑纪伟.柳树转录组高通量测序及SSR标记开发研究［D］.南京：南京林业大学，2013：29.

［11］陆嘉惠，李学禹，马 淼，等.甘草属植物DNA提取方法研究［J］.生物技术，2006，16（3）：45-47.

A modified method of DNA extraction from Salix

ZHENG Ji-wei1，2，SUN Chong1，2，ZHOU Jie1，HE Kai-yue2，HE Xu-dong1*

（1.Jiangsu Academy of Forestry，Nanjing 211153，China；2.College of Forestry Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

High quality DNA is critical in the study of forest molecular biology.In the present study，a method of DNA extraction from Salix babylonica was modified and compared with regular CTAB method，CTAB-silicon bead cracking method，SDS method and DNA extraction kit method.Agarose gel electrophoresis result showed that the concentration and purity of extracted DNA were superior to the other four methods by using modified CTAB method.Through the validation of extraction from 16 species and hybrids of Salix and amplification of SSR-PCR，we concluded that the modified CTAB method could be universal for genomic DNA extraction of Salix sp.

Salix；DNA extraction；Modified CTAB method

S792.12

A

10.3969／j.issn.1001－7380.2014.06.002

1001－7380（2014）06－0004－03

2014-09-15；

2014-10-15

江苏省自然科学基金项目“垂柳全长CDNA文库的构建及功能标记的开发”（BK2011871）；江苏省林业科学研究院青年基金项目“国内杨柳科主栽品种指纹图谱的构建”（Y0003）

郑纪伟（1986－），男，河南嵩县人，硕士，主要从事植物学研究。

*通信作者：何旭东（1981－），男，江苏句容人，助理研究员，博士，主要从事林木遗传育种研究。E-mail：hxd－519＠163.com。