PCR定量检测肺炎支原体在肺炎支原体肺炎中的应用分析

陈奕霞，彭颂国，苏秀琼 (.广东省惠州市中医医院，广东 惠州 5600;.中山大学附属肿瘤医院，广东 中山50060)

PCR定量检测肺炎支原体在肺炎支原体肺炎中的应用分析

陈奕霞1，彭颂国2，苏秀琼1(1.广东省惠州市中医医院，广东 惠州 516001;2.中山大学附属肿瘤医院，广东 中山510060)

目的：探讨PCR定量检测在肺炎支原体肺炎诊断中的可行性及优越性。方法：选取186例接受治疗的肺炎患者，分别用MP快速培养法和实时PCR进行检测。记录并比较两组检测方法下的灵敏度及特异性等相关数据。结果：快速培养法与实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的灵敏度、阳性预测值、假阴性率及诊断符合率差异无统计学意义(P＞0.05);实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的特异性为85.5%(65/76)，明显高于快速培养法的77.6%(59/76)，假阳性率为14.5%(11/76)，明显低于快速培养法的22.4%(17/76)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：快速培养法与实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的敏感度差别不大，而实时PCR法的特异性优于快速培养法。临床上应用这两种不同原理的检测方法组合检测，取长补短，在提高肺炎支原体感染检出率的同时，还可以互相佐证，减少实验误差，提高检测的准确性。

PCR定量检测;肺炎;支原体;阳性预测值

肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是一种最常见的病原体，易侵入小儿体内导致呼吸道受到感染［1］。肺炎支原体临床表现多样，以各种呼吸道器官炎性反应最为多见，如咽炎、肺炎等［2］。此外，肺炎支原体还会导致呼吸器官外的全身各脏器受损，对儿童身体的危害性极大。近年婴幼儿感染率达25% ～69%，并且感染率还有逐年上升的趋势［3］。目前检测MP的方法并不唯一。以前临床诊断MP感染一般采用血清学方法，但检测结果易受多方面因素的影响，如患者的身体状况、病情的严重程度等，使得早期诊断MP感染的难度增加［4］。随着分子生物学技术的发展，近年来实时PCR法广泛应用于肺炎支原体的检测中。该法不受患者自身病情的影响，能快速、精准的检测到肺炎支原体的存在。本文对PCR定量检测法和其他检测法进行了对比，旨在探讨该法在临床诊断中的应用价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取186例于2012年11月～2013年7月在我院接受治疗的肺炎患者。其中男111例，女75例。年龄范围为3个月～17岁，平均(5±4.3)岁。纳入标准：①持续剧烈咳嗽;②全身症状比胸部体征明显;③X射线所见较体征显著，胸片可见片状阴影的出现，肺门阴影增浓;④白细胞数量正常或稍微偏高，血沉多增快;⑤用大环内酯类药治疗病情迅速缓解。⑥均有肺炎症状和(或)体征，经一般抗生素及抗病毒药物治疗无效。排除标准：①有呼吸系统疾的患者;②患心脏病者;③有精神系统疾患病史及家族史的患者。

1.2 诊断方法：所有患者均于住院当天无菌采集咽试子标本，分别用MP快速培养法和实时PCR进行检测。MP快速培养：将咽拭子置于培养基瓶内搅动数次后，取出咽拭子，密封瓶盖，置于37℃孵箱中培养24 h后观察结果。实时PCR检测：向咽拭子中加入1 ml无菌生理盐水混匀。然后高速离心10 min，舍去上清向离心管内加入120 μl的DNA浓缩液混匀。再接着高速离心10 min，弃上清向离心管内加入25 μl DNA提取液。然后100℃恒温处理10 min，高速离心5 min，取3ul进行PCR反应测定。

1.3 观察指标：记录并比较两组检测方法下的灵敏度及特异性等相关数据。

1.4 统计学方法：所有数据均由SASS 13.0统计分析软件分析。组间数据采用t检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同性别的MP阳性检测结果：MP快速培养法检出的阳性结果为107例，其中男67例，感染率为58.6%(67/111)，女42例，感染率为56.0%(42/75);实时PCR检测出的阳性患者为104例，其中男63例，感染率为56.8%(63/111)，女41例，感染率为54.7%(41/75)。这两组数据表明无论用哪种方法检测，男性与女性的MP感染率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 快速培养法检测MP结果和临床诊断结果比较：见表2，快速培养法对肺炎支原体肺炎诊断的灵敏度、特异度分别为81.8%(90/110)、77.6%(59/76)，阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)分别为84.1%(90/107)和74.7%(59/79)，假阳性率、假阴性率分别为22.4%(17/76)、18.2%(20/110)，诊断符合率为80.1%(149/186)。

表1 不同性别的MP阳性检测结果［例(%)］

表2 快速培养法检测MP结果和临床诊断结果比较(例)

2.3 实时PCR法检测MP结果和临床诊断结果比较：见表2，实时PCR法检测MP对肺炎支原体肺炎诊断的灵敏度、特异度分别为84.5%(93/110)、85.5%(65/76) ，PPV、NPV分别为89.4%(93/104)和79.3%(65/82)，假阳性率、假阴性率分别为14.5%(11/76)、15.5%(17/110)，诊断符合率为84.9%(158/186) ，见表2。

表3 实时PCR法检测MP结果和临床诊断结果比较(例)

2.4 实时PCR法检测与快速培养法检测MP的比较：将表2、3的数据进行统计学分析，结果发现两种方法的灵敏度、阳性预测值、阴性预测值、假阴性率和诊断符合率的比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的特异度为85.5%(65/76)，明显高于快速培养法的77.6%(59/76)，假阳性率为14.5%(11/76)，明显低于快速培养法的22.4%(17/76)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

近年来，导致儿童出现肺炎的主要病原体即为MP，其临床症状不典型，易导致误诊、漏诊，故早期诊断、及时治疗非常重要［5］。流行病学资料显示，MP感染主要通过呼吸道飞沫传播，易感人群是4～20岁，婴幼儿也可发病［6］。该病原体的发病年龄和易感年龄并不一致，调查发现，学龄前儿童和学龄儿童最易发病［7］。本研究不同性别的MP阳性检测结果表明，虽然肺炎支原体肺炎的发病年龄集中在龄前儿童和学龄儿童期，但其发病与性别无关，男女的发病率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。新生儿MP发病初期缺乏特异的临床特征，多以上呼吸道感染开始，肺部X线表现多样，以肺纹理增多为主。痰、鼻和咽拭子培养可获肺炎支原体，临床上一般采用该方法进行诊断［8］。但是支原体在培养基上生长速度缓慢，达到能检测到的标准用时较长，难以满足早期诊断要求。随着分子生物学技术在支原体研究领域的应用，PCR技术已经成为较快检测支原体感染的方法。实时PCR整个操作只要数个小时，且可减少假阳性的干扰，亦可了解MP在患儿体内的复制情况［9］。

快速培养法是近年发展起来的一种直接检测MP病原体的实验室方法，具有简便，快速，敏感的优点。因为这种培养液里面添加了高营养成分和快速生长因子，即使加入极少量的支原体也可以在短时间内快速增殖，一天内即可得到结果。所以该方法在发病初期也能检测得到MP［10］。本研究结果显示，快速培养法与实时PCR法诊断肺炎支原体肺炎的灵敏度、阳性预测值、假阴性率及诊断符合率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。快速培养法虽然比一般的培养时间大大缩短，但是其与实时PCR法相比特异性较低、出现假阳性的比例较大。本研究结果显示，快速培养法的特异性为77.6%(59/76)，假阳性比例为22.4%(17/76)，与实时PCR的85.5%(65/76)和14.5%(11/76)相比，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。分析出现这两点差异的可能原因为：①可能与快速培养法使用的培养液有关，标本中的真菌也能在培养液中生长引起假阳性;②快速培养法只有在MP存活的情况下才能够检出，而PCR法并不依赖这一点。

综上所述，实时PCR可快速、准确的检测到患者体内的MP，值得在临床上推广应用，为肺炎支原体肺炎的早期诊断、治疗提供重要的依据。然而该方法也存在不足之处，尽管PCR技术不断改善，但仅靠这一种方法诊断MP感染是不够的，并且该方法易受标本来源和试剂特异性的影响。如能将多方法结合用于MP感染的早期检测，不但有利于疾病的诊断，而且可以有效地避免漏检，提高检测的准确性，为临床医生提供快速可靠的检验依据。

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Application Analysis of Quantitative PCR detection of Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniae pneumonia

CHEN Yi－xia，PENG Song－guo，SUN Xiu－qiong(1.Huizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong516001，China;2.Affiliated Cancer Hospital of Sun Yat－sen，Guangzhou510060，China)

ObjectiveTo investigate the quantitative PCR in the diagnosis of mycoplasma pneumonia feasibility and superiority.Methods186 cases of patients with pneumonia were treated with MP rapid culture method and the real－time PCR testing respectively.the sensitivity and specificity of two methods data were compared.ResultsThe diagnosis of mycoplasma pneumonia sensitivity，positive predictive value，false negative rate and diagnostic accuracy of rapid culture method and real－ time PCR had no significant difference(P＞0.05);mycoplasma pneumonia diagnosis specificity of Real－ time PCR was 85.5%(65/76)，significantly higher than 77.6%of rapid culture(59/76)，the false positive rate was 14.5%(11/76)，significantly lower than the 22.4%of rapid culture(17/76)，the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionsThe rapid culture method and real－time PCR diagnosis of mycoplasma pneumonia sensitivity have no different，but the specificity of real－ time PCR method is superior to rapid culture method.The clinical application of the principles of these two different combinations can improve the detection rate of Mycoplasma pneumoniae infection，while also supporting each other，to reduce experimental error and improve the accuracy of detection.

Quantitative PCR;Pneumonia;Mycoplasma;Positive predictive value

2013－08－05 编校：李晓飞］