豆渣固体发酵生产灵芝菌丝粉条件优化及三萜化合物含量的测定

王世强，李雨桐，唐巧巧

（黄山学院 生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041）

灵芝俗称芝草、仙草、瑞草。在分类学上属于真菌担子菌门、层菌纲、非褶菌目、灵芝科、灵芝属[1，2]。灵芝富含多糖、蛋白质、多肽类、三萜类化合物（灵芝酸）、有机锗、甾体皂甙及多种微量元素，是著名的药用菌。灵芝多糖、三萜类化合物是灵芝的主要活性物质[3，4]，是灵芝发挥扶正固本、提高自身免疫能力，促使机体器官机能正常化功效的物质基础。据研究，灵芝菌丝体中的粗多糖含量明显高于灵芝子实体及孢子粉中多糖的含量，其菌丝体中粗多糖含量是老化期子实体中粗多糖含量的6倍，是灵芝孢子粉中粗多糖含量的2.8倍[5]。

一般非谷物性培养料固体法培养灵芝菌丝，不具有可食性；采用谷物性培养料固体法培养灵芝菌丝，由于多糖测定方法相同，培养料淀粉多糖与菌丝多糖难以分离测定，效果难以确定；人们一直以来采用液态发酵生产获得灵芝纯菌丝体，但液态发酵生产菌丝体设备昂贵、生产技术要求高，菌丝产量低。本研究旨在通过灵芝菌丝所含特征化合物—三萜化合物测定，以解决培养物中灵芝菌丝含量的测定方法，探讨豆渣代料固体法生产可食性、灵芝菌丝粉的可能性，为富含灵芝多糖、三萜类化合物灵芝菌丝粉大规模生产及应用提供参考。

1 ．材料与方法

1.1 材料与仪器

豆渣葡萄糖培养基：豆渣为黄山市农贸市场购买；

韩芝（休宁食用菌研究所）；

齐墩果酸（上海金穗生物科技有限公司）。

齐墩果酸标准对照品溶液：精确称取105℃干燥至恒重的齐墩果酸对照品0.0046g于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容；

香草醛（天津市光复精细化工研究所），香草醛溶液：5g香草醛用100ml冰醋酸进行溶解；硫酸溶液(V/V)：取水 28ml，加硫酸至 100ml。

MJ－160B－Ⅱ型恒温恒湿培养箱（上海跃进医疗器械厂）；

YX280A型高压蒸汽灭菌器 （上海三申医疗器械有限公司）；

FA2104-B型电子天平 （上海越平科学仪器有限公司）；

pH-300型酸度计（上海天达仪器有限公司）；

SW-CJ-IC型超净工作台 （苏州安泰空气技术公司）；

721分光光度计（上海天普分析仪器有限公司）；

DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海三发科学仪器有限公司）；

THZ-82B型气浴恒温振动器（江苏金坛医疗仪器厂）；

HH-S4数显电热恒温水浴锅（金坛岸头仪都仪器厂）；

冰箱。

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝菌丝粉生产工艺流程

固体发酵法：斜面菌种→原种→接种→培养→灵芝菌丝培养物→60℃烘干→粉碎→过筛→样品灵芝菌丝粉；液体发酵法：斜面菌种→接种入100ml马铃薯蔗糖液体培养基→26℃,140-150rpm摇瓶培养14d→过滤取菌丝→60℃烘干→研磨→纯灵芝菌丝粉[6，7]。

1.2.2 显色方法[8]

实验采用的显色方案为5%香草醛-冰醋酸0.5ml，72%硫酸 5ml，65℃恒温水浴加热 20min，冰水中静置5min后测定。

1.2.3 齐墩果酸标准曲线[9]

分别精密量取齐墩果酸标准溶液0.0ml(空白)、0.1ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml置于 10ml具塞容量瓶中，即配成的溶液浓度为0.0000mg/ml、0.0046mg/ml、0.0184mg/ml、0.0368mg/ml、0.0552mg/ml、0.0736mg/ml，用乙酸乙酯定容至10ml，按1.2.2显色方法显色，以空白为参比，于532nm波长处测定各溶液的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=2.1344x-0.0023；R2=0.9963。

1.2.4 样品的测定

样品中三萜化合物测定通常采用齐墩果酸作为对照品。分别精密称取试验样品及纯灵芝菌丝粉0.2g置于100ml烧瓶中，加氯仿约90ml，置水浴中加热，回流1h后，冷却至室温，转移入100ml容量瓶中，用氯仿稀释至刻度，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，再滤液备用。

精密吸取三萜类化合物提取液1.0ml于10ml比色管中，按1.2.2项“加热挥去溶剂后”进行操作，测定吸光度，计算含量。

1.2.5 灵芝培养基及培养条件

豆渣含有丰富的蛋白质，碳水化合物，参考一般天然成分固体培养基添加糖为1%左右，灵芝菌丝生长温度为6-35℃，菌丝发满容器后5-10d 即可现菇蕾（菌丝老化）的固体法灵芝菌丝体的营养发育条件[10，11]，选用料糖比、培养温度、菌丝满瓶后再培养时间作为豆渣固体法灵芝菌丝体培养的考察因素，取其各自不同的水平进行正交实验，以单位重量菌丝粉三萜化合物含量作为评价指标，实验设计见表1。

表1 灵芝培养基及培养条件的因素水平表

2 结果与分析

2.1 不同处理豆渣培养基上灵芝菌丝生长势状况

样品中灵芝菌丝三萜化合物含量与灵芝菌丝生长状况密切相关，在菌丝培养的中期通过放大镜观察菌丝生长状况，通过瓶壁菌丝10d菌丝蔓延伸长值的测定，除以10换算菌丝培养中期日伸长值；每瓶装干豆渣80g，使其含水量达65%左右，通过培养料在瓶中相同的重量及松紧度，菌丝日伸长值，菌丝发满时间考察菌丝的生长势；菌丝培养物60℃烘干后粉碎，称重。结果见表2。

表2 不同处理豆渣培养基上灵芝菌丝生长势

由表2可知,菌丝生长势与菌丝培养温度、培养料/糖比密切相关。在同一料/糖比条件下，菌丝生长势受温度影响，2、5、8号实验组，其菌丝日伸长最高，可见灵芝菌丝最适宜的生长温度为28℃，其他实验组在24℃或32℃培养，可能由于酶的活性降低，生长势减弱；菌丝日伸长与菌丝发满瓶正相关而成反比，日伸长值越高，发满菌瓶时间越短。在同一温度条件下，菌丝生长势受料/糖比影响，4、5、6 号实验组料/糖比为2%，菌丝平均日伸长最高，为0.561mm。

2.2 灵芝菌丝体培养条件的优化

依据表1的工艺参数，进行正交实验，结果见表3。

表3 正交实验结果表

从表3中的数据分析可知，根据极差的大小，影响灵芝菌丝中三萜化合物含量的影响因素的顺序是：A〉B〉C，即料/糖比，培养温度，培养时间对灵芝菌丝中三萜化合物含量的影响依次减小，通过直观性分析可知：利用豆渣培养基培养灵芝菌丝体的最佳条件为 A2B1C3，即料/糖比为 100：2；培养温度为24℃；培养时间为长满瓶后12d，有利于菌丝三萜化合物的积累。结合表2分析可知，高浓度的糖组菌丝粉得率高，但菌丝粉三萜化合物含量低，显示高浓度糖对原料的利用、菌丝生长及三萜化合物的积累有抑制作用。

2.3 液体发酵与固体发酵灵芝菌丝体结果比较

以固体发酵培养灵芝菌丝体影响因子最大，最佳料/糖比为100：2的菌丝粉得率平均值与液体发酵培养灵芝菌丝体得率结果比较见表4。

表4 液体发酵与固体发酵灵芝菌丝体结果比较

从表4可看出,其固体发酵每g菌丝粉中三萜化合物的量较低，为纯菌丝粉中三萜化合物50.1%，是由于固体发酵菌丝粉其中含有部分培养料，菌丝粉不纯的原因。但固体发酵法菌丝粉得率高，三萜化合物总量高。

3 结 论

1.利用豆渣培养基培养灵芝菌丝体，菌丝生长势与菌丝培养温度、料/糖比密切相关。培养温度在28℃，料/糖比为 100：2，菌丝生长势最强，菌丝满瓶时间最短。

2.以单位重量菌丝粉含三萜化合物量为目标函数，利用豆渣培养基培养灵芝菌丝体的最佳条件则为料/糖比为100：2；培养温度为24℃；培养时间为菌丝长满瓶后12d。尽管固体发酵法菌丝粉三萜化合物含量低，但固体发酵法菌丝粉得率高，三萜化合物总量高，80g固体发酵物三萜化合物总量是100mL液体发酵纯菌丝三萜化合物总量的16.3倍。

4 讨 论

1.豆渣是豆制品的下脚料，豆渣中含脂肪6-19%，粗蛋白13-16%，粗纤维和碳水化合物60-70%，可溶性膳食纤维5-8%[12]。本实验证明豆渣是灵芝菌丝培养的良好基料，即变废为宝减少污染，又增加效益。

2.液体深层发酵法能获得纯菌丝粉，但设备昂贵、通气、搅拌耗电，易被污染，技术难度大，菌丝体得率低。固体发酵法虽然菌丝粉纯度只有纯菌丝的40-50%，但培养基原料易得、廉价，省去通气搅拌电耗，不易污染，技术难度低，菌丝体得率高，可大规模工厂化生产。

3.近年来，以谷物作为基料进行灵芝固体发酵的研究较少，高文庚等采用玉米、小麦、大豆作为发酵基质，对最终产品——灵芝发酵粉中灵芝粗多糖、还原糖、蛋白质、游离氨基酸含量进行测定分析[13]，但样品中淀粉对灵芝粗多糖含量测定结果影响难以避免。基于菌丝细胞生长——细胞各成分有规律按比例增加原理。本试验通过对样品及纯菌丝特有三萜化合物的测定，可间接了解样品中菌丝体的含量和灵芝菌丝多糖的含量，该菌丝粉可食性也为灵芝功能性食品及保健品的开发开辟了广阔的前景。

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