响应面法优化苦参总黄酮的提取工艺

兰艳素，赵 严，张婷婷，桂 生，任文强

（黄山学院 化学化工学院，安徽 黄山 245041）

苦参为豆科植物，在国内各省区均有分布，而且产量较高。[1]研究发现苦参具有减缓心率、扩张血管平喘以及消炎等作用，经常被用于治疗热痢、便血、皮肤瘙痒、滴虫性阴道炎等[2]，是我国应用比较广的传统中药。[3]

苦参中黄酮类成分的含量较高，到目前为止，已经从苦参中分离得到100余种黄酮类化合物[4]，研究结果显示，苦参中所含的黄酮类化合物不仅具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗心率失常、祛痰等作用[5]，还在降低血糖和抗糖尿病并发症等方面具有比较好的活性[6]。

本文采用微波法进行提取，Box-Behnken效应面法优化苦参总黄酮的提取工艺参数，以期为苦参的进一步研究提供一定的参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

苦参购于安徽亳州（批号：110601），经鉴定为豆科槐属植物苦参Sophora flavescenes Ait.的干燥根，芦丁标准品(批号：10080-200707，购于中国药品生物制品检定所)；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器

UV-2100型紫外可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器有限公司）；MCR-3S型常压微波合成萃取仪 （巩义市予华仪器有限公司）；高速离心机TG165（长沙平凡仪器仪表有限公司）；电子分析天平 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 芦丁标准曲线的制作

精密称取10.2mg芦丁标准品，溶解后，转移至50mL容量瓶中，最后用60%乙醇定容至刻度线，摇匀即得浓度为0.204mg/mL芦丁标准溶液。精密量取标准溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.5mL，混合均匀，放置6min，然后加入10%硝酸铝溶液0.5mL，摇匀后放置6min，最后加4%的氢氧化钠溶液4mL，用60%乙醇溶液定容至刻度线，混匀，静置15min后，在510nm波长处测定溶液吸光度值。得到标准曲线：A=11.2382C-0.0302，R2=0.9997，线性关系良好。

2.2 苦参总黄酮的提取及测定

称取已经处理好的苦参粉末，置于250mL干燥的圆底烧瓶中，加入适量、一定体积分数的乙醇溶液，浸泡苦参药材1h后，在一定的微波功率下提取一定时间，所得提取溶液冷却后，低速离心机离心8min，过滤，移取过滤后提取液5mL，用乙醇定容于25mL容量瓶中作为待测溶液，再用移液管量取2.0mL待测液置于10mL容量瓶中，按2.1项下的实验方法进行显色后测定吸光度值，最后按照下式计算出苦参总黄酮的得率(以芦丁计)。

C为标准曲线计算出的总黄酮浓度(mg/mL)；N为稀释倍数；V为提取液体积(mL)；M为样品质量（g）。

2.3 单因素试验

参考相关文献[7-8]，试验选定4个单因素分别为乙醇体积分数、提取时间、液料比和微波功率，考察各因素对苦参总黄酮提取率的影响。

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

图1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

由图1可以看出，乙醇体积分数为50%和60%时，总黄酮的提取率均比较低，且相差不大。之后总黄酮提取率随乙醇含量的增加而迅速增加，当乙醇体积分数为80%时，总黄酮的提取率达到最大值。综合考虑，确定乙醇体积分数为80%。

3.1.2 提取时间对总黄酮提取率的影响

图2 提取时间对黄酮提取率的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，总黄酮提取量缓慢增加，当提取时间为6min时，提取率为13.32mg/g，相对较高，但若超过6min，苦参中总黄酮提取量反而减少，因此提取时间选取6min。

3.1.3 液料比对总黄酮提取率的影响

图3 液料比对黄酮提取率的影响

由图3可知，当液料比在15：1到25：1之间变化时，黄酮提取率随着液料比的扩大而快速增加，当液料比为25：1时提取率达到最大值，之后缓慢减少。原因可能是当苦参药材量一定，加入乙醇溶液的量越多，可以使药材和溶剂的接触越充分，非常有利于黄酮成分的溶出，黄酮提取率越高，但当乙醇量达到一定程度后，促进作用就没有那么明显了，综合考虑，选取液料比为25：1。

3.1.4 微波功率对总黄酮提取率的影响

图4 微波功率对黄酮提取率的影响

由图4可见，随着微波功率的增加，总黄酮提取率呈先上升后下降，在400W时总黄酮的提取量最大，但当微波功率大于400W时，却呈现出快速下降趋势，可能是因为微波功率过大，温度升高较快，过高的能量会破坏已经提取得到的黄酮类化合物的结构，因而选取微波功率为400W。

3.2 Box-Behnken效应面法优化提取工艺

3.2.1 实验设计与结果

在单因素试验所得数据的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以苦参总黄酮提取率为响应值，进行4因素3水平的响应面试验设计，并以1、0、-1表示自变量的高低水平，各因素水平编码见表1，实验结果见表2。

表1 因素水平编码表

表2 实验设计与结果

3.2.2 模型方程的建立及显著性检验

利用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，拟合后，得到回归模型方程Y=12.69+0.1742X1+0.1450X2+0.2525X3+0.0417X4-0.1300X1X2-0.1150X1X3+0.01750X1X4-0.03250X2X3-0.1225X2X4+0.035X3X4-0.7088-0.1351-0.5413-0.5176。

表3 苦参总黄酮提取率方差分析结果

由表3可知，模型的F值为20.04，P〈0.0001，表明实验所得的回归模型方程极显著。液料比的P〈0.0001，影响极显著，即液料比的改变对总黄酮提取率的影响最强，乙醇体积分数和提取时间次之，微波功率的影响最不显著。二次项中对响应值的影响均达极显著水平，的偏回归系数达差异显著水平。方程的交互项均未达到显著水平(P〉0.05)，说明因素之间的交互作用对黄酮提取率的影响较小。

该模型方程的失拟项P=0.3138，影响不显著，因此可以对苦参总黄酮的提取工艺参数进行优化及预测。

3.2.3 效应面优化和预测

利用Design-Expert8.0.6软件，以黄酮提取率为响应值，固定乙醇体积分数、微波时间、液料比、微波功率其中之一为中心点值，绘制得到影响较显著的三维效应曲面见图5。

图5 各因素交互作用影响黄酮得率的响应面曲线图

图5A为微波功率与液料比对黄酮提取率的交互影响曲面图，由图可知，随着液料比、微波功率的增加，黄酮提取率呈现先增加后减少的趋势，在微波功率在400W左右、液料比在25：1附近存在最佳点。观察图5B可看出，乙醇体积分数和微波功率对黄酮提取率的交互作用影响曲面开口向下，影响比较显著，随着微波功率提高和乙醇体积分数的增大，总黄酮提取率速率增加达到最高点后缓慢下降。图5C中显示，液料比和乙醇体积分数交互作用响应面弯曲度较大，表明这两个因素的交互作用对苦参总黄酮提取率具有显著影响，液料比和乙醇体积分数较低时，提取率也很低，之后呈现先快速升高后快速减少的趋势，当乙醇体积分数80%、液料比为25：1时，总黄酮提取率最高。

通过软件分析，预测总黄酮提取率最大值为12.75mg/g，微波法辅助提取苦参总黄酮的最优提取工艺条件为：乙醇体积分数80.61%，提取时间6.4min，液料比 26.06：1mL/g，微波功率 399.3W。

为了便于操作，将工艺条件取整修正，并在修正后的条件下做平行实验5次，测得平均总黄酮提取率为12.67mg/g，与预测值相符。

4 结 论

在单因素试验结果的基础上，利用Design Expert8.0.6软件进行Box-Behnken试验设计，并采用响应面分析法对微波辅助提取苦参总黄酮的工艺进行优化，得到最优工艺条件为乙醇体积分数80%，提取时间 6min，液料比 25：1(mL/g)，微波功率400W，在该工艺条件下，总黄酮提取率为12.67mg/g，比模型预测值少0.08mg/g，相对误差为-0.6%。因此，采用响应面法优化得到的苦参总黄酮的提取工艺可靠，具有较高的应用价值。

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