右心室心尖部起搏对Beagle犬心室肌ERK1/2磷酸化水平的影响

程俊华 洪 俊 郑 程 陈学思 陈星星 赵景琳 李 进 林加锋

右心室心尖部起搏对Beagle犬心室肌ERK1/2磷酸化水平的影响

程俊华 洪 俊 郑 程 陈学思 陈星星 赵景琳 李 进 林加锋

目的探讨右心室心尖部起搏对Beagle犬心室肌电重构及细胞外信号调节激酶（ERK）1/2磷酸化水平的影响。方法成年雄性Beagle犬12只，年龄3～4年，体重20～24kg，随机分为对照组（n=6）和起搏组（n=6），均植入DDD起搏器后程控至关闭状态，起搏组术后1周时开启起搏器并使心室起搏最大化。于术前及术后1周、4周关闭起搏器后行心电图及超声心动描记术检查，术后4周时处死动物，观察心肌病理结果，采用免疫印迹法检测犬右心室心肌总ERK1/2及其磷酸化水平的变化。结果两组心室肌病理及超声心动描记术、心率、QRS时间、总ERK1/2的表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与对照组相比，术后4周时起搏组Tp-e间期、Q-T间期均增大，p-ERK增多（均P＜0.05）。结论右心室心尖部起搏可以导致心肌复极延长及促进心肌ERK1/2的磷酸化。

心室起搏；电重构；ERK1/2磷酸化

细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）是将胞外刺激信号传导至细胞核的重要通路之一。有研究表明，ERK1/2信号转导通路是调节心肌细胞肥大和心室肥厚的重要因素[1]。起搏器在治疗心力衰竭的同时，也可以引起心肌的解剖重构和电重构[2-3]，心肌的这种电重构被认为是致心律失常的重要基础，也是心力衰竭恶化的重要机制。但心肌的电重构与ERK1/2的磷酸化水平是否有关尚且未知。本研究拟评价右心室心尖部起搏对犬Tp-e间期、Q-T间期、QRS时间及射血分数、心室腔大小、心室肌病理结果、B型脑钠肽（BNP）及心肌ERK1/2水平的影响，从分子水平探讨起搏引起心室电重构的机制。

1 材料和方法

1.1 药品和仪器戊巴比妥钠（批号：20110615，上海西塘生物科技有限公司），ERK1/2和p-ERK1/2的单克隆兔抗体（一抗，Cell Signaling，美国），CAPDH多克隆兔抗体（一抗，北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG抗体（二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司），ECL化学发光试剂盒（环亚生物科技有限公司），BNPELISA试剂盒（上海希美生物科技有限公司），起搏导线（Medtronic CaPSureFixm Novus 5076主动导线，美国），永久性心脏起搏器（Medtronic SD303 DDD，美国），C型臂心血管造影机（西门子，德国），数字式十二道心电图机（SE.1200 ExPress，深圳理邦精密仪器有限公司），起搏器程控仪（Medtronic 9790，美国），小动物呼吸机（DW-3000，淮北正华生物仪器设备有限公司）。

1.2 实验动物与分组健康成年雄性Beagle犬12只,购于南京亚东实验动物研究中心[SCXK（苏）2011．0013]。于温州医科大学普通动物房不锈钢笼单只饲养，室温（20±5）℃，相对湿度55%±15%。采用随机数字表法将12只Beagle犬分成两组：对照组（n=6），体重（21.81±1.23）kg，始终关闭起搏器；起搏组（n=6），体重（21.43±1.48）kg，术后1周拆线并测量完电生理及解剖重构指标后开启起搏器，程控并缩短A-V间期至60ms,以保证右心室最大起搏率，持续起搏3周后关闭起搏器。

1.3 方法

1.3.1 DDD起搏器的植入实验动物术前禁食12 h，禁水4h。3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，约半小时后达松口指征，必要时术中追加麻醉。剃去犬前胸、颈下及四肢内侧毛发，清洗消毒上述部位。送入介入导管室，将其仰卧位固定于手术台上，行气管插管,呼吸机辅助呼吸（SIMV模式，呼吸频率20次/min，潮气量10～20ml/kg，氧流量4～6L/ min，吸入氧浓度40%～60%。连接肢体导联，描记体表12导联心电图。

颈部及前胸部皮肤常规消毒、铺巾，Seldinger′s法穿刺右上腔静脉,依次送入导引钢丝、7F静脉撕开鞘及Medtronic CaPSureFixm Novus 5076主动固定导线，在X线引导下将2根主动固定导线分别经上腔静脉送至右心耳及右心室心尖部,在X线透视下稳定导线头端后旋出导线（一般旋出15～16圈），随后撤出导丝，调整导线张力。导线参数检测：要求心房、心室起搏阈值＜1.0V，R波振幅＞5.0mV，A波振幅＞2.0mV，两者阻抗在400～1 000Ω。然后缝扎固定心房、心室主动固定导线。制皮下隧道将心房、心室主动固定导线引至开胸部位，在其皮下制作囊袋,将起搏器与心房、心室主动固定导线尾端连接并植入囊袋内。测试起搏器起搏功能状态，确定起搏功能状态良好后关闭起搏器，缝合皮下组织及皮肤。回笼静养。术后3 d内每天肌肉注射青霉素160万U预防感染；7d内每天换药1次；术后1周时伤口愈合良好，无红肿及流液，予以拆线。

1.3.2 电生理重塑及解剖重构指标的测定分别于术前、术后1周及术后4周时行超声心动描记术检查，测量指标包括：左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）、舒张期室间隔厚度（IVSDd）、收缩期室间隔厚度（IVSSd）和左心室射血分数（LVEF），左心室短轴缩短率（FS），胸骨旁长轴切面测量左心房前后径（LAD）。行12导联心电图检查测量QRS时间、Q-T间期及Tp-e间期。抽空腹血查血浆BNP浓度。术后1周测量完毕后开启起搏组起搏功能，程控起搏参数，缩短A-V间期至60ms，起搏模式VAT，以保证最大心室起搏率，术后4周时程控并关闭起搏器，然后重复测量上述指标，测量完毕后处死动物，迅速分离右心室心肌组织，一部分放入甲醛中保存做HE病理切片，一部分迅速放入液氮，转入-80°冰箱备用。

1.3.3 ERK1/2及其磷酸化水平的测定取冻存的右心室心肌组织，加入组织裂解液，冰上匀浆，超声破碎，4℃下12 000r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。取50μg蛋白上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，电泳条件：恒压，浓缩胶70V，分离胶120V。电泳结束后进行蛋白转膜，转膜条件：PVDF膜，恒流，电流300mA，冰上转膜40min。印迹膜在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中封闭2 h，TBST漂洗3次，每次10min，分别与ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH的一抗（1：1000）进行杂交反应，4℃过夜，TBST漂洗3次，每次10min。PVDF膜与HRP标记的山羊抗兔二抗（1：5 000）室温下摇床杂交反应2 h，再用TBST漂洗3次，每次10 min，加ECL化学发光反应2 min，采用AlhaimagerTM 2200图像分析系统进行处理，AlphaEase40软件进行分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，方差齐时两组间比较采用Student′s t检验，多个样本的比较采用方差分析。

2 结果

2.1 两组术后表现两组Beagle犬术后均无感染、气胸等并发症、无厌食、气促、精神萎靡，无胸腔积液、颈静脉怒张等心力衰竭症状与体征。

2.2 两组模型起搏前后心电图、超声心动描记术指标及BNP的变化见表1。

由表1可见，两组术前、术后1周、术后4周组内和组间心率、QRS时间、超声心动描记术指标、BNP等差异均无统计学意义（均P＞0.05）；在Q-T间期及Tp-e间期方面，对照组术前、术后1周、4周及起搏组术前、术后1周之间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），起搏组术后4周较术前、术后1周及对照组术后4周延长（均P＜0.05）。

2.3 两组模型总ERK1/2及其磷酸化水平比较见表2、图1。

表1 两组模型起搏前后心电图、超声心动描记术指标及BNP的变化

表2 术后4周时两组p-ERK1/2、总ERK1/2的相对表达水平

图1 术后4周时两组p-ERK1/2、总ERK1/2、GAPDH蛋白的免疫印迹结果。

由表2、图1可见，与对照组比较，起搏组术后4周时右心室心肌表达的总ERK1/2差异无统计学意义（P＞0.05），而p-ERK1/2水平明显增高（P＜0.05）。

2.4 病理检查结果两组心肌组织排列整齐，均无心肌细胞的水肿、坏死、钙化及心肌肥大和纤维化，无炎性细胞的浸润，未发现心力衰竭细胞等病理改变。两组术后4周的右心室心肌组织无明显差异，见图2。

3 讨论

心脏电生理重构是指由于激动频率和（或）激动顺序的变化导致心肌电生理特性的持续性改变[4]。这种改变主要表现在心肌复极时间延迟、动作电位时程延长、有效不应期离散度增加，以及心肌电生理异质性增加。已有实验表明，跨室壁复极离散度的延长是引起体表心电图T波改变的决定性因素，而Tp-e间期（T波顶点至T波终点的时间）是反映复极离散度程度的重要指标，对室性心律失常的预测和评估有重要价值[5]。

图2 术后4周时两组右心室心肌组织光学显微镜图像（HE染色）。A.起搏组（×20），B.起搏组（×40），C.对照组（×20），D.对照组（×40）。

起搏器在心力衰竭治疗中运用广泛，但是起搏器由于改变了生理起搏顺序和收缩的不同步而导致心肌的电重构和解剖重构[3]。本研究通过改变心脏激动顺序，建立心室肌电重构模型，然后测试电生理及解剖重构指标，此方法简便易行，模型稳定。有研究表明，心室内膜起搏1周可以产生稳定的长期记忆，然而心外膜起搏需要2～3周,但起搏时间足够长可由电重构转变为解剖重构，因此本研究选择起搏3周为时限。结果表明，两组超声心动描记术指标及病理切片无明显差异，未发生解剖重构，BNP无统计学差异，未发生心功能不全，起搏组起搏3周后关闭起搏器测得心电图Q-T间期、Tp-e间期较对照组延长，表明右心室心尖部起搏3周产生了心肌的电重构而未发生解剖重构。本研究结果还表明心肌电重构可以独立于解剖重构，并且可以领先于解剖重构。

已有大量研究表明，ERK1/2磷酸化后才具有活性，心室肥厚和心肌细胞肥大与ERK1/2的激活有关[6]。另外，机械牵拉可以激活Na+/H+交换离子通道，进而刺激细胞肥大基因的表达增加，使用特异性阻断剂HOE649可以阻断机械牵张引起的心肌细胞内ERK的活化，说明机械牵张可能通过激活Na+/H+交换的离子通道引起ERK1/2的活化。

本研究结果发现，与对照组比较，尽管心室起搏3周后，起搏组的心室肌ERK1/2无差异，但ERK1/ 2的磷酸化水平升高，进一步提示ERK1/2的激活参与了心室肌电重构的形成。另有研究表明，机械牵张可以激活心肌细胞ERK[7]。心肌细胞自身的机械牵张可改变细胞轴向的伸长，促进ERK的磷酸化，导致激活子蛋白1（AP1）和环磷酸腺苷应答元件结合蛋白（CREB）的激活，从而促进缝隙连接蛋白43的极化和表达[8]，进而影响心肌细胞之间的电传导，这可能是心室起搏引起心肌电重构的机制。

综上所述，右心室心尖部起搏可以引起心室肌ERK1/2的磷酸化，可能是其产生心肌电重构的分子机制。

[1]Fernandez-Twinn D S,Blackmore H L,Siggens L,et al.The programming of cardiac hypertrophy in the offspring by maternal obesity is associated with hyperinsulinemia,AKT,ERK,and mTOR activation [J].Endocrinology,2012,153（12）：5961-5971.

[2]信鹏程,陈一和,李岳春,等.经股动脉途径射频消融术建立beagle犬永久性房室传导阻滞模型[J].浙江医学，2013,35（5）：330-340.

[3]Vo T T T,Thibault B,Finnerty V,et al.Canine left ventricle electromechanical behavior under different pacing modes[J].J Interv Card Electrophysiol,2012,35（1）：11-17.

[4]Aiba T,Tomaselli G F.Electrical remodeling in the failing heart[J]. Curr Opin Cardiol,2010,25（1）：29-36.

[5]徐涛,廖德宁.Tp-Te间期的细胞电生理基础和临床价值[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2010,24（6）：480-482.

[6]Tarone G,Sbroggio M,Brancaccio M.Key role of ERK1/2 molecular scaffolds in heart pathology[J].Cell Mol Life Sci,2013,70（21）：4047-4054.

[7]Sbroggio M,Carnevale D,Bertero A,et al.IQGAP1 regulates ERK1/ 2 and AKT signalling in the heart and sustains functional remodelling upon pressure overload[J].Cardiovasc Res,2011,91（3）：456-464.

[8]Salameh A,Wustmann A,Karl S,et al.Cyclic mechanical stretch induces cardiomyocyte orientation and polarization of the gap junction protein connexin43[J].Circ Res,2010,106（10）：1592-1602.

The effect of right ventricular apical pacing on ERK1/2 phosphorylation in Beagle myocardium

CHENG Junhua，HONG Jun,ZHENG Cheng,et al．Department of Cardiology,The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou325000,China

LIN Jiafeng,E-mail:linjiafeng@medmail.com.cn

Objective To investigate the effects of right ventricular apical pacing on electrical remodeling and ERK1/2 phosphorylation in beagle myocardium.Methods12 male beagles,3-4 years old,underwent DDD pacemaker implantation and were randomly divided into two groups(n=6).The pacemakers were turned on and programmed to ensure ventricular pacing 1 week after implantation in pacing group and turned off all the time in control group.The ECG and UCG were recorded before,1 and 4 weeks after procedure with the pacemaker turned off.The beagles were sacrificed 4 weeks after procedure and phosphorylated ERK1/2 of right ventricular myocardium was determined by Western blotting.Results There was no statistical difference in the expression of ERK1/2,heart rate,QRS duration,BNP,ventricular myocardial pathology and parameters of UCG between the two groups.Tpeak-Tend interval and QT duration were prolonged and the expression of phosphorylated ERK1/2 increased in pacing group compared with control group(P＜0.05)4 weeks after procedure.Conclusion Right ventricular apical pacing may induce myocardial repolarization prolongation and promote ERK1/2 phosphorylation of myocardium.

Ventricular pacing;Electrical remodeling;ERK1/2 phosphorylation

2014-02-25）

（本文编辑：马雯娜）

国家自然科学基金资助项目（项目编号：81070155）

325000温州医科大学附属第二医院心内科

林加锋，E-mail：linjiafeng@medmail.com.cn