消栓通络片中水溶性成分的提取及质量控制

叶晓萍

（惠州学院 化学工程系，广东 惠州 516007）

引言

消栓通络片是由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中药组成，具有活血化瘀，温经通络功效【1-2】。君药川芎、丹参、郁金中含有水溶性酚酸类化合物［3-5］，其中原儿茶醛和咖啡酸具有广泛的抑菌、抗病毒、扩张心脑血管、抗血小板凝集作用，原儿茶醛清除氧自由基等作用较二萜醌类的丹参酮更强。消栓通络片的非水溶性成分含量指标已有报道［6-7］，但水溶性成分含量指标至今没此方面的质量标准。苟小锋等用电化学色谱法对此进行了研究［8］，但方法复杂且仪器昂贵。本研究利用TLC与PHLC，对消栓通络片中主要水溶性药效成分的提取及定性、定量方法进行了研究，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器、药品

AgiLent1100液相色谱仪(安捷伦，紫外检测器)；5HU系列超声波清洗器(天津恒奥科技)；HL—01溶剂过滤器；高速离心机；PHS-3C酸度计；LD－10LG－E1超纯水机。

咖啡酸、原儿茶醛（Sigma公司），甲醇（色谱纯））；消栓通络片（黑龙江天宏药业，批号：20060201），乙醇、醋酸乙酯、乙醚、甲酸、甲苯、三氯化铁、醋酸碳酸钠（分析纯）川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂（同仁堂）。

1.2 供试品溶液的提取

取消栓通络片10片，去包衣研碎，加乙醇25mL，超声30min，放冷过滤，滤液蒸干。残渣加15mL水溶解，用稀盐酸调节PH值至2～3，加适量醋酸乙酯，超声波提取3次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液，再用2%碳酸钠溶液超声波提取3次，每次10mL，合并碳酸钠提取液，用水饱和的乙醚20mL洗涤，弃去乙醚液，用稀盐酸调节PH值至2～3，用乙醚超声波提取3次，每次15mL，合并乙醚提取液，挥干，残渣加无水乙醇1.0mL溶解后，作为供试品溶液1#，用于薄层色谱（TLC）定性分析。

取本品20片，去包衣，研细，称重为2.0563g，加入甲醇10.0mL，称重后超声提取4次，每次1h，静置过夜后用甲醇补足减失的重量，在3000r.min-1下离心15min，吸取上清液5.0mL于10mL量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液2#，用于高效液相（HPLC）定量定性分析。

取本品5片，除去包衣，研碎，加甲醇30mL，超声30分钟，放冷过滤，滤液蒸干，残渣加水15mL使溶解，用醋酸乙酯振摇提取2次，每次15mL，合并醋酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液3#质，TLC定性分析和HPLC定量定性分析。

1.3 对照品溶液的制备

取两份原儿茶醛对照品适量，一份加入无水乙醇制成质量浓度为0.5000g.L-1原儿茶醛对照品溶液1#用于TLC定性分析；一份加入甲醇制成质量浓度为0.0803g.L-1原儿茶醛对照品2#溶液，再取咖啡酸对照品加甲醇制成质量浓度为0.0200g.L-1的咖啡酸对照品溶液，两者均用于HPLC定量定性分析。

1.4 阴性样品溶液的提取

按方抓取川芎、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十味药材，将冰片和三七各粉碎成细粉；其余八味加水煎煮三次，合并煎液，过滤，滤液水浴浓缩成清膏，加入三七粉，烘干，制成粉末，干燥，再加入冰片粉，混匀，即得阴性样品粉未。将阴性样品粉未按供试品溶液1#制法制成阴性样品溶液1#，用于TLC定性分析。再取阴性样品粉末约2g照供试品溶液2#的提取制备方法制备成阴性样品溶液2#，HPLC定量定性分析。

2 结果与讨论

2.1 TLC法的定性鉴别

吸取1.2～1.4项下的所有1#溶液各10mL，在25ºC、湿度65%下分别点于同一硅胶G薄板上，以甲苯：醋酸乙酯：甲酸（10：5：0.5）为展开剂，展开后取出晾干，喷以1%三氯化铁-乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，如图1。从图1知，各成份斑点清晰、分离度好。在供试品色谱A与对照品色谱B相应的位置上，显相同颜色的斑点，但在与阴性样品色谱C相应位置上未发现任何斑点；吸取供试品溶液3#、咖啡酸对照品和阴性对照品溶液1#各5mL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯光（365nm）下检视。结果表明，展开显色后，各有效成份斑点清晰、分离度好。在供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而在阴性样品色谱中相应位置上未发现任何斑点（图略）。说明消栓通络片中含有原儿茶醛、咖啡酸，且来都自于丹参，无阴性干扰。

Fig.1 TLC chromatograms of XiaoShuanTongLuo tabLets（A），protocatechuaLdehyde reference substances（B）and Negative sampLes withouts Danshen（c）

2.2 HPLC法对消栓通络片定量方法

2.2.1 流动相的选择

在波长为280nm下，分别在0.1%～2.5%冰醋酸：甲醇＝85：15的六种流动相下测定对照品溶液2#。结果原儿茶醛的保留时间随酸度增大依次缩短，峰的对称度增大；在波长为320 nm下，以不同配比的甲醇：水：冰乙酸：三乙胺配为流动相，测咖啡酸对照品溶液。结果发现在流动相中加入三乙胺可使峰的对称度、分离度增大，而咖啡酸的保留时间随酸度增大依次缩短。两种系列都与C18柱的特点相结合考虑，最终选2.0%冰醋酸：甲醇＝85：15和甲醇：水：冰乙酸：三乙为11：89：2.0：0.3为流动相。

2.2.2 柱温的选择

吸取对照品2#溶液10μL，在30℃～45℃下测定（图2）。由图2知40℃为最佳柱温。同样，咖啡酸对照品溶液10μL上述相同之处温度下测定，结果是30℃时最佳（图略）。

图2不同柱温下的原儿茶醛对照品色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances of coLumn temperature at 30℃（A），40℃（B）and 45℃（C）

2.2.3 流速的选择

在流速为0.6～1.0(mL.min-1)下测试对照品2#溶液，发现它们的出峰时间渐短，考虑到消栓通络片成分的复杂性及原儿茶醛要与其它成分有效分离等因素，确定流速为0.8mL.min-1，保留时间为10.963。同理测定咖啡酸对照品溶液的最佳流速为0.8mL.min-1，其保留时间为22.398min。

2.2.4 干扰性分析

吸取上述所有2#溶液，在原儿茶醛的色谱条件下测定，原儿茶醛对照品谱图见图2中A图，样品及阴性样品图见图3。对比图3和图2（A），可确定谱图3-A中保留时间为10.963的峰为原儿茶醛，而图3-B中，原儿茶醛的保留时间内没有出峰。同样，分别吸取上述咖啡酸对照品溶液、供试品溶液2#及阴性样品溶液2#，在咖啡酸的色谱条件下测定，得图4。观察图4，可确定图4-B中保留时间为22.398 min的峰为咖啡酸，而图4-C中，在咖啡酸的保留时间内没有出峰。综上进一步说明原儿茶醛和咖啡酸来自丹参，药中其它成分无干扰，与相邻的杂质分离好。

图3 供试品（A）阴性样品（B）液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms XiaoShuanTongLuo tabLets sampLe（B）and Negative sampLes withouts Danshen（c）

2.2.5 标准曲线的绘制

分别吸取原儿茶醛对照品2#溶液及咖啡酸对照品溶液各0.5、1、2、3、4、5、6、15、20μL，测定峰面积，外标峰面积法得原儿茶醛回归方程y=434314x+18625，在0.040～1.606μg内呈线性；咖啡酸为y=200580x+15672，在0.010～0.400μg内呈线性，相关系数均为0.9998。

2.2.6 供试品中原儿茶醛及咖啡酸含量的测定

取20片药品，按1.2项下供试品溶液2#制备方法制备，吸取10μL溶液测定，得原儿茶醛含量为0.109 mg.g-1即0.011 mg/片，RSD=1.09% ，咖啡酸的含量为0.121 mg.g-1，即0.012 mg/片，RSD=0.85%，（n=3）。

2.2.7 精密度试验，稳定性试验

分别吸取对照品溶液2#和咖啡酸对照品溶液各20μL，在各自色谱条件下重复测定5次，原儿茶醛的RSD=0.12%，咖啡酸的RSD=0.57%；同理在0～48h内每间隔3h测定供试品溶液2#一次，以便考查方法的稳定性，结果原儿茶醛的RSD=1.22%，咖啡酸的RSD=0.53%。

2.2.8 加样回收率试验

精密移取供试品2#溶液各100μL，分别加入已加浓度为160.6ug.mL-1的原儿茶醛对照品及200.0ug.mL-1的咖啡酸对照品溶液各12μL，混匀，按2.2.6法测定，计算原儿茶醛平均回收率为100.46%，RSD=0.97%（n=5），咖啡酸平均回收率为99.84%，RSD=0.08%（n=5）。

3 结论

3.1 原儿茶醛具有酸性，在中性流动相中因存在着离解平衡，使其色谱峰严重的拖尾现象，加入少量醋酸可抑制其离解，减少拖尾。

3.2 采用薄层色谱法，以原儿茶醛为检测指标时，考虑了不同醇沉浓度对原儿茶醛提取的影响。结果表明，用浓度为50%～60%的醇沉原儿茶醛损失较小，但用水作提取溶媒更有利于原儿茶醛的溶出，不过仅超声30min提取原儿茶醛并不完全，而浸泡有利于原儿茶醛的溶出。即原儿茶醛水溶性成分提取工艺为：用水浸泡过夜再提取。溶剂pH对水溶性成分提取的有影响：随着PH值升高，原儿茶醛含量显著降低，在PH 9.2时已很微量；这表明，溶剂PH值是影响原儿茶醛提取效果的一个非常重要的因素。

3.3 本实验的TLC和HPLC法的专属性强，二者能相互印证说明药中其它成分对分离测定无干扰，消栓通络片中的主要水溶性药效原儿茶醛、咖啡酸均来自于丹参，川芎、郁金中不含有，所以工厂在生产时一定要注意丹参的采购质量及其加工提取过程中的工艺控制。此研究方法简便可行，快捷，准确度及灵敏度高，可用于工厂及药监部门做为质量标准。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京：化学出版社，2000，568-569.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京：化学出版社，2005，580-5819.

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［5］易进海，陈燕，李伯刚，等.郁金化学成分的研究［J］.天然产物研究与开发，2003，15（2）：98.

［6］叶晓萍，骆小伟，吴仲夏，等.消栓通络片中主要药效成分质量控制［J］.郑州大学学报;自然科学版，2009.41（4）;89-92.

［7］朱丽萍，反相高效液相色谱法测定消栓通络片中芦丁含量［J］.中国药业，2009，18（23）：26-27.

［8］苟小锋，索志荣，曹炜，等.消栓通络片中3种酚酸的高效液相色谱电化学检测［J］.药物分析杂志，2005，25（10）：1215-1218.