HPLC法同时测定黄酒中4种非法食品添加剂

陈军

(常州市粮油质量监督检测站，江苏常州 213000)

HPLC法同时测定黄酒中4种非法食品添加剂

陈军

(常州市粮油质量监督检测站，江苏常州 213000)

建立高效液相色谱同时测定黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠4种非法食品添加剂的方法。黄酒中的待测物质经提取后，采用C18柱分离，以甲醇-乙酸铵溶液为流动相进行洗脱，在波长230 nm处用高效液相色谱-二极管阵列检测器进行测定。安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠的质量浓度在0.5～200.0 μg/mL范围内与其色谱峰面积的线性关系良好(r＞0.999 7)，检出限为0.29～0.74 μg/L。在0.5，1.0，2.5，5.0，7.5 mg添加水平时的平均回收率在95.6%～104.0%范围内，测定结果的相对标准偏差为0.3%～1.5%(n=6)。该方法操作简便，分离效果好，灵敏度高，结果稳定可靠，适合于黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠的同时测定。

黄酒；高效液相色谱法；安赛蜜；苯甲酸；山梨酸；糖精钠

黄酒是一种低酒精度的酿造酒，含有多种氨基酸及微量元素，被誉为“液体蛋糕”［1］。黄酒以大米、黍米等为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成［2］。著名的黄酒有无锡惠泉酒、绍兴加饭酒、丹阳封缸酒、福建龙岩沉缸酒和即墨老酒等［3］。在黄酒生产过程中生产企业可以根据需要适量添加焦糖色素(通过普通法、氨法或亚硫酸铵法制得)［4］，但禁止添加安赛蜜(乙酰磺胺酸钾)、苯甲酸、山梨酸、糖精钠［5］，这4种食品添加剂分别有增加甜味及防腐作用。在江苏省质量技术监督局主导的黄酒产品质量监督抽查中，根据《黄酒产品质量监督抽查实施规范》要求必须检测这4个指标［6］。目前，国内已有分别测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的方法［7-10］，但没有出台同时测定这4种物质的国家标准。分开检测费时费力，不但不能提高仪器使用效率，还影响整个监督抽查工作的进度。笔者研究了同时检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的方法，旨在为大批量的黄酒样品的快速、准确检测与便捷数据处理提供参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1200LC型，带G1315D型二极管阵列检测器和LC 3D系统化学工作站，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：BSA2202S型，德国赛多利斯科学仪器有限公司；

超声波清洗器：AS20500A型，天津奥赛恩斯仪器有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-6型，常州国华电器有限公司；

超纯水机：Direct-Q3型，法国Millipore公司；

黄酒样品：生产企业成品库随机抽取；

亚铁氰化钾溶液：106 g/L；

乙酸锌溶液：220 g/L；

氨水溶液：0.1%；

乙酸铵溶液：0.02 mol/L；

甲醇：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司；

苯甲酸溶液[GBW(E)100006]、山梨酸溶液[GBW(E)100007]、糖精钠溶液[GBW(E)100008]：均为1 mg/mL，中国计量科学研究院；

安赛蜜溶液（BW3510）：5，50，100，500，1 000 μg/mL，中国计量科学研究院；

标准工作溶液：量取适量标准溶液，用水稀释配制成所需浓度混合标准溶液，其中苯甲酸、山梨酸、糖精钠为20，40，100，200 μg/mL，安赛蜜为0.5，10，100，200 μg/mL；

实验所用试剂除注明外均为分析纯；

实验用水：一级水。

1.2 样品处理

称取5.00 g试样于50 mL比色管中，在水浴锅上去除酒精，用0.1%氨水调节pH至中性，分别加入2 mL亚铁氰化钾溶液和2 mL乙酸锌溶液(用于沉淀蛋白质)，定容至标线，混匀，放置2 h，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，待上机分析。

1.3 液相色谱条件

色 谱 柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；流动相：甲醇-乙酸铵溶液(体积比为5∶95)，流量为0.7 mL/min；柱温：30℃；检测波长：230 nm；进样体积：10 μL。

1.4 测定方法

按1.3测定标准工作溶液和样液，以待测物色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的标准工作溶液质量浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。同时记录待测物质的光谱图，并与标准品光谱图(见图1～图4)对照进行定性分析。

图1 安赛蜜(乙酰磺胺酸钾)标准品光谱图

图2 苯甲酸标准品光谱图

图3 山梨酸标准品光谱图

图4 糖精钠标准品光谱图

1.5 色谱图

按1.3色谱条件进样分析，色谱图见图5。

图5 安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精色谱图

2 结果与分析

2.1 色谱条件试验

2.1.1 检测波长

在214，220，225，230 nm处分别检测混合标准溶液，出峰顺序依次为安赛蜜(6.4 min)、苯甲酸(7.9 min)、山梨酸(11.0 min)和糖精钠(13.2 min)。结果表明，安赛蜜、山梨酸在214 nm处峰高最小，在225，230 nm处峰高较大；苯甲酸峰高变化不大；糖精钠在230 nm处峰高最小，在214 nm处峰高最大。综合考虑检测的适用性和灵敏度，实验选择230 nm为检测波长。

2.1.2 流动相

固定检测波长，分别考察乙酸铵溶液(0.02 mol/L)、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸铵溶液等作为流动相对于待测物色谱峰的影响。

结果表明，采用乙酸铵溶液作为流动相时出峰时间较长；采用甲醇-水溶液、乙腈-水作为流动相时几乎不出峰，基线出现漂移；采用甲醇-0.02 mol/L乙酸铵溶液(体积比为5∶95)作为流动相，能够很好地分离出4个峰，15 min内就可以完成一次检测，为了尽量减少黄酒中夹杂物质(如糖分)对色谱柱的污染，实验设置检测时间为25 min，以保证一定的时间冲洗色谱柱。

2.1.3 色谱柱与柱温

实验选用安捷伦公司配备的ZORBAX Eclipse XDB-C18柱进行检测，待测物质的峰形和保留时间都较好，故没有考虑其它型号的色谱柱。

在检测波长和流动相固定以后，对不同的柱温(25，30，35℃)进行考察。结果表明，柱温的改变，对待测物质的保留时间和灵敏度影响不大，但随着柱温降低柱压有所下降，实验选择柱温为30℃，既接近常温，又有较小的柱压，可以得到较为理想的色谱峰形和保留时间。

2.1.4 流速的选择

固定检测波长、流动相、柱温、色谱柱，选择流速为0.7 mL/min与1.0 mL/min进行比较。结果表明，选用流速为1.0 mL/min时，虽然出峰时间缩短，但4个峰紧密的排列在一起；选用流速为0.7 mL/min时峰形分离效果较好，故选择流动相流速为0.7 mL/min。

2.2 工作曲线及检出限

根据所确定的实验条件，取系列浓度的混合标准溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，其中安赛蜜的浓度为0.5，10，100，200 μg/mL，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的浓度为20，40，100，200 μg/mL。在上述质量浓度范围内，质量浓度c与其对应的峰面积A呈良好线性关系(r＞0.999 7)，线性方程与线性相关系数见表1。

表1 线性方程与线性相关系数

按3倍信噪比除以线性方程的斜率计算检出限［11］，本次检测的仪器噪音为0.008 1，进样量10 μL。则各待测物质检出限：安赛蜜为0.57 μg/L；苯甲酸为0.53 μg/L；山梨酸为0.29 μg/L；糖精钠为0.74 μg/L。

2.3 精密度试验与加标回收试验

在1.3色谱条件下，以未检出本底的某黄酒样品做基质，在0.5，1.0，2.5，5.0，7.5 mg添加水平时，每个添加水平重复6次测定，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 黄酒中4种添加剂的加标回收试验与精密度试验结果

结果表明，安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的加标平均回收率在95.6%～104.0%范围内，测定结果的相对标准偏差在0.3%～1.5%范围内，回收率和精密度均满足实验要求。

3 结语

建立了用高效液相色谱仪同时检测黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的方法。该方法简便、快速、结果稳定可靠，检出限、回收率和精密度均符合残留分析要求，适用于大批量的黄酒样品的快速准确检测与便捷数据分析。

［1］傅金泉.黄酒生产技术［M］.北京：化学工业出版社，2005: 9-10.

［2］GB/T 13662-2008 黄酒［S］.

［3］黄酒.360百科［OL］：http://baike.so.com/doc/2704012.html.

［4］郝利平.食品添加剂［M］.北京：中国农业出版社，2004: 112-113.

［5］GB 2760-2011 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准［S］.

［6］CCGF 103.3-2010 黄酒产品质量监督抽查实施规范［Z］.

［7］GB/T 5009.28-2003 食品中糖精钠的测定［S］.

［8］GB/T 5009.29-2003 食品中山梨酸、苯甲酸的测定［S］.

［9］GB/T 5009.140-2003 饮料中乙酰磺胺酸钾的测定［S］.

［10］GB/T 23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法［S］.

［11］GB/T 5009.1-2003 食品卫生检验方法 理化部分 总则［S］.

Simultaneous Determination of Four Kinds of Illegal Food Additives in Chinese Rice Wine by HPLC

Chen Jun
(Supervision and Examination Station of Grain and Oil Products Quality of Changzhou City，Changzhou 213000，China)

A method of simultaneous determination of four kinds of illegal food additives in Chinese rice wine by high performance liquid chromatography(HPLC)-diode array detector was established. The sample was extracted by water，detection wavelength was 230 nm，ZORBAX Eclipse XDB-C18was used for chromatographic separation，and methanol-ammonium acetate aqueous solution was used as mobile phase. The mass concentration has good relationship with the chromatographic peak area in the range of 0.5-200.0 μg/mL(r＞0.999 7)，and the detection limit was 0.29-0.74 μg/L. The relative standard deviations of determination results were 0.3%-1.5%(n=6). The average recovery rates were 95.6%-104.0%. This method is simple，accurate，sensitive and suitable for the simultaneous determination of illegal food additives in Chinese rice wine.

Chinese rice wine; HPLC; acesulfame-K; benzoic acid; sorbic acid; sodium saccharin

O657.7

A

1008-6145(2014)03-0061-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2014.03.017

联系人：陈军；E-mail: chen_jun05@yeah.net

2014-02-12