三聚氰胺酶联免疫试剂盒检测牛奶样品结果浅析

王远丽

（新疆昌吉州畜产品质量检测中心，新疆 昌吉 831100）

三聚氰胺酶联免疫试剂盒检测牛奶样品结果浅析

王远丽

（新疆昌吉州畜产品质量检测中心，新疆 昌吉 831100）

为探索牛奶中三聚氰胺检测的快速有效方法，本试验采用酶联免疫检测方法对随机抽样的一批牛奶样本进行三聚氰胺检测，经过检测分析本实验准确度平均为91.2%，板内变异系数均小于10%；标准品曲线拟合系数R2为0.9579，曲线拐点为2；检测数据可靠，实验较为成功，说明抽测样品符合国家相关标准。本试验的结果表明，三聚氰胺酶联免疫试剂盒检测牛奶样品结果可靠，可用于生产中牛奶样品的三聚氰胺初筛。

三聚氰胺；酶联免疫；结果分析

牛奶中违法添加三聚氰胺提高劣质奶的蛋白检测含量，对人体危害很大，曾在国内造成轰动。影响酶联免疫吸附试验（ELISA）具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点，能最大限度地减少检测操作的误差和工作强度，目前已广泛应用于食品安全、农药残留和兽药残留等领域的监测工作。但对于检测数据处理、检测结果的可靠性、判断疑似阳性结果确有些模糊，本文从三聚氰胺ELISA检测数据着手，充分分析实验报告各项数据，详细评价实验数据。

1 材料与方法

1.1样品采集

2013年6月对昌吉市辖区内奶牛养殖场的牛奶样本进行抽检，随机抽检10份样本，用三聚氰胺酶联免疫试剂盒（以下简称ELISA试剂盒，北京望尔生物技术有限公司生产，产品编号CA301）快速检测方法进行初步筛查，对疑似阳性样本再进行液相色谱法分析确认。

1.2 ELISA试剂盒操作简介

使用前将试剂盒在室温（20℃～25℃）放置30 min，使用前将液体试剂摇匀。

从样品中取20 μL牛奶样本直接测定。

按每个标准品溶液和样本溶液至少两个平行样计算，将所需数目的酶标板条插入板架中。

加标准品或样本液20 μL至微孔后，再加酶标二抗50 μL/孔，抗体工作液80 μL/孔，轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板，25℃下避光反应20 min。

倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体，加250 μL洗涤工作液至每个孔中，5 s后再倒掉孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。再加250 μL洗涤工作液，重复操作4～5次。

加底物液A液和B液各50 μL/孔，轻轻振荡混匀于25℃下避光放置10 min显色。

加终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，置酶标仪于450/630 nm波长处测量吸光度值。

2 结 果

以标准品百分吸光率为纵坐标，以三聚氰胺标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准线上读出样本所对应的浓度见表1、表2和图1。

表1 标准品对照

表2 样品测定结果

图1 牛奶中三聚氰胺检测标准曲线

本实验准确度为（87.7%+47.3*2%）/2=91.2%；板内、板间变异系数为表1所列的标准品和样本的变异系数值，均小于10%；标准品曲线拟合系数R2为0.9579，曲线拐点为2；检测数据可靠，实验较为成功。检测样本中最高的8号样品数值为14.1 μg/kg，未超出国家标准，全部检测的10份样本检测数值均符合国家限量标准。

3 讨 论

3.1 准确度

本试剂盒检测牛奶准确度应为100%+15%，本实验的准确度为（87.7%+47.3*2%）/2=91.2%，在要求的区间范围100%+15%之内，这项指标是表示待检物在样品分析过程中的损失程度，损失越少，回收率（准确度）越高。在实验过程中添加阳性样本（一般添加国家要求的定量限的1-2倍）是为了验证整个实验过程的可信度，包括样品的前处理，点板等过程。鉴于本实验不需要前处理，直接取20 μL牛奶样品直接测定，所以91.2%说明阳性添加样品的前处理过程的回收率较高，整个点板操作过程是值得可信的，否则所得数据不可靠，实验应该重做。同时作标准曲线时直线回归、曲线回归均有多种常用方式可采用，各有特点。

3.2 精密度

试剂盒板内板间变异系数均小于10%，本次实验板内变异系数均小于10%。这说明使用的试剂盒重复性好，检测员洗板操作规范一致，检测员在洗板过程中未出现板干燥的情况，洗板拍干后及时进行了下一步操作。

3.3 灵敏度

此试剂盒灵敏度为5 μg/kg，试剂盒灵敏度值愈低，试剂盒愈好。在选购试剂盒时，相同试剂盒选灵敏度值低的检测值较准确。另外，试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。

3.4 最低检测限

此方法最低检测限5 μg/kg，小于GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》定量限2.0 mg/kg，也小于GB/T 22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》检测限为50 μg/kg，能够满足我们的检测要求，可以选用此试剂盒。另外，试验结果中低于5 μg/kg的值均为超出检测范围，表示未检出。

3.5 曲线拟合系数R2

表二中的R2曲线拟合系数愈接近1愈好，一般要求在0.95以上；在洗板过程中如果出现板干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3.6 拐点

point of inflection拐点一般要求小于等于3，本次实验为2。

3.7 OD值

0标准的吸光度（450/630 nm）值小于0.5时，表示试剂可能变质，应当弃之不用。室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温会导致所有标准的OD值偏低。

3.8 样本的结果

每个标准品和样本的浓度值应减去空白孔的浓度值。例如8号样品最终所得数值应为：15.3-1.2= 14.1 μg/kg；在Linear Regression直线图中若直线与X轴的交点小于浓度最大值，则说明存在系统误差，最大可能是温度低于说明中要求的温度25℃。

本试验的结果表明，三聚氰胺酶联免疫试剂盒检测牛奶样品结果可靠，可用于生产中牛奶样品的三聚氰胺初筛。

[1]《生物体系中的化学测量》Kent k.Stewart Richard E.EBDL著.

[2]赵晓联,等.酶联免疫吸附法在食品分析中的应用[J].卫生研究,1998,（V27）：82-84.

[3]赵晓联,等.酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1误差分析[J].中国卫生检验杂志,2001，8第11卷(4).

[4]耿庆华，等.农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立[J].动物医学进展，2012，(03).

The Results Analyses of Melamine Detection in Milk by Melamine ELISA Kit

WANG Yuan-li
（Changji Livestock Testing Center，Changji 831100，China）

For finding an effective method to rapidly detect melamine in milk,the ELISA kit is used to detect melamine for random sampling of milk samples.the result show that the analysis of the experiment averaged 91.2%and The coefficient of variation within the board less than 10%;fitting coefficient of standard curve t R2 is 0.9579,inflection point of the curve 2;detection data are reliable.indicating that sampling tests samples meet the relevant national standards.The results of this experiment show that the ELISA kits to detect melamine in milk samples results are reliable and can be used in the production of melamine screening milk samples.

melamine;milk;ELISA;analysis result

S817.3

：A

：1003－6377（2014）03－0066-03

2014-04-16

王远丽（1978-），女，兽医师，主要从事畜产品质量安全检测、监管工作及畜牧养殖技术服务工作。