降钙素和1,25维生素D拮抗牙周炎大鼠牙槽骨丧失的疗效观察

许崇游 马艳华 盛君曼 殷 恺

降钙素和1,25维生素D拮抗牙周炎大鼠牙槽骨丧失的疗效观察

许崇游 马艳华 盛君曼 殷 恺△

目的探讨降钙素与1,25维生素D对牙周炎导致大鼠牙槽骨丧失的影响。方法雄性Wistar大鼠125只随机分为空白对照组（A组）、牙周炎对照组（B组）、降钙素治疗组（C组，降钙素溶于生理盐水，2 μg/kg，皮下注射）、1,25维生素D治疗组（D组，维生素D溶于花生油中，2 μg/kg，灌胃）、降钙素和1,25维生素D联合治疗组（E组），每组25只。用正畸结扎丝结扎上颌磨牙牙颈部加高糖软食的方法建立牙周炎大鼠模型。在第2、4、6和8周末各组处死5只大鼠，测量双侧上颌第一磨牙牙周探诊深度（PD），观察牙槽骨水平；第8周末各组采取10只大鼠腹部降主动脉血，用酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测血清中的骨碱性磷酸酶（BALP）及骨钙素（OC）的浓度。结果4周、6周、8周时E组大鼠的PD低于B、C、D组（P＜0.05）。6周、8周时E组大鼠牙槽骨丧失水平低于B、C、D组（P＜0.05）。第8周时E组BALP及OC浓度显著高于B、C、D组（P＜0.05）。结论降钙素和1,25维生素D均能部分拮抗牙周炎导致的牙槽骨丧失，二者联合应用效果更佳。

牙周炎；降钙素；二羟胆钙化醇类；牙槽骨质丢失；骨钙素；碱性磷酸酶；1，25维生素D

牙周炎是最常见的口腔疾病之一，可导致牙槽骨的破坏吸收，造成牙齿松动脱落。近年研究表明，牙周炎引起的牙槽骨吸收，除各种炎性因子的作用外，其吸收程度还与宿主维生素C、维生素D的缺乏，钙、磷的缺乏或不平衡等易感因素相关[1]。降钙素与1,25维生素D可调节钙代谢、维持血清钙磷浓度的稳定，抑制骨吸收。目前关于降钙素及维生素D对牙周炎导致牙槽骨丧失的影响尚少见报道。本研究拟通过建立大鼠牙周炎模型，并对其应用1,25维生素D及降钙素，观察牙周探诊深度（probing depth，PD）、牙槽骨水平及血清骨代谢指标的变化情况，初步探索降钙素和1,25维生素D对牙周炎导致的牙槽骨丧失的拮抗作用，为牙周炎的辅助治疗探索一种新的可行方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级成年雄性Wistar大鼠125只，2月龄，体质量200～220 g，购于军事医学科学院实验动物中心。实验动物以及实验使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。

1.2 药品与仪器 骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司，大鼠特异性骨钙素（osteocalcin，OC）EIA检测试剂盒（美国BTI公司），多功能酶标仪（芯起点基因科技有限公司），降钙素（批号H20040452，规格：50 U/mL，Novartis制药，瑞士），1,25维生素D（骨化三醇，批号H20030491，规格：0.25μg/粒，青岛正大海尔制药）。

1.3 方法

1.3.1 牙周炎模型的建立及动物分组 将125只大鼠采用随机数字表法随机分成A、B、C、D、E 5组，每组25只。B、C、D、E组用10%水合氯醛（0.5 mL/100 g）经腹腔注射麻醉，待大鼠进入麻醉状态后，用直径为0.2 mm的正畸结扎丝（在结扎丝上缠绕4-0医用缝合线）环绕大鼠双侧上颌第一磨牙牙颈部结扎，颊侧打结。A组麻醉后不做处理，待大鼠清醒后归笼，并用普通颗粒饲料喂养。B、C、D、E组用致牙周病食谱（Keyes diet 2000）[2]喂养。至此，A组为空白对照组，B组为牙周炎组，C组为降钙素组，D组为1,25维生素D组，E组为降钙素和1,25维生素D联合用药组。

1.3.2 降钙素和1,25维生素D治疗 建模成功后，A组、B组每日灌服等剂量生理盐水。C组：降钙素溶于生理盐水，2 μg/kg皮下注射，每日1次。D组：维生素D溶于花生油中，2 μg/kg灌胃，每日1次。E组：C组、D组治疗方法合用。

1.3.3 观察指标 每组分别于第2、4、6、8周各组处死5只大鼠，在10%水合氯醛全麻下采用自制的大鼠探针对大鼠双侧上颌第一磨牙临床牙周指标进行检测。（1）PD采用自制牙周探针测量各组大鼠上颌第一磨牙颊面远中、近中、中央，舌面远中、近中、中央6个位点的探诊深度，取平均值。（2）大鼠处死后取上颌骨，去净双侧磨牙区软组织，用1%亚甲基蓝液显示牙槽嵴顶的位置。测量每颗牙颊面远中、近中、中央，舌面远中、近中、中央6个位点釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离，取6个位点测量值的均值作为该牙的牙槽骨丧失水平值。

1.3.4 ELISA法检测血清BALP及OC的水平 经过8周治疗，用水合氯醛对每组10只大鼠进行腹腔注射麻醉，切开腹腔，取腹部降主动脉血5～6 mL，静脉注射空气处死大鼠。动脉血3 000×g离心10 min，吸取上清液，-80℃深低温冰箱中保存。择日采用ELISA法进行血清中BALP及OC检测。严格按照试剂盒操作说明进行。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件包分析数据，符合正态分布和方差齐性计量资料采用均数±标准差（±s）表示。多组资料间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠PD比较 用药2周，B组大鼠的PD高于A组（P＜0.05）。B组与C、D、E组PD差异无统计学意义（P＞0.05）；用药后4周、6周和8周，B组PD均高于A、C、D、E组（P＜0.05），且E组PD低于C组和D组，见表1。

Table 1 Comparison of probing depth between five groups of rats表1 5组大鼠用药后PD变化比较 （n=5，mm±s）

Table 1 Comparison of probing depth between five groups of rats表1 5组大鼠用药后PD变化比较 （n=5，mm±s）

＊＊P＜0.01；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，d与D组比较，均P＜0.05；表2、3同

组别A组B组C组D组E组F 2周0.20±0.01 0.57±0.01a0.56±0.02a0.56±0.01a0.56±0.02a3 403.986＊＊4周0.22±0.01 0.84±0.01a0.71±0.01ab0.72±0.01ab0.62±0.01abcd4 596.282＊＊6周0.22±0.01 1.12±0.04a0.90±0.04ab0.88±0.01abc0.81±0.01abcd1 720.205＊＊8周0.22±0.01 1.42±0.04a0.98±0.03ab0.96±0.01ab0.84±0.02abcd2 967.968＊＊

2.2 各组大鼠牙槽骨丧失水平比较 用药2～4周，B组大鼠牙槽骨丧失水平高于A组（P＜0.05），B组与C、D、E组牙槽骨丧失水平差异无统计学意义（P＞0.05）；用药6周和8周时，B组牙槽骨丧失水平高于C、D、E组（P＜0.05），且E组低于C组和D组，见表2。

Table 2 Comparison of alveolar bone loss between five groups of rats表2 5组大鼠用药后牙槽骨丧失水平比较（n=5，mm±s）

Table 2 Comparison of alveolar bone loss between five groups of rats表2 5组大鼠用药后牙槽骨丧失水平比较（n=5，mm±s）

组别A组B组C组D组E组F 2周0.20±0.01 0.52±0.01a0.53±0.02a0.53±0.01a0.52±0.01a1 829.375＊＊4周0.22±0.01 0.66±0.01a0.67±0.02a0.67±0.01a0.66±0.01a1 558.028＊＊6周0.23±0.01 0.89±0.01a0.76±0.02ab0.77±0.02ab0.71±0.01abcd2 421.820＊＊8周0.24±0.01 1.14±0.03a0.79±0.03ab0.81±0.02ab0.72±0.02abcd1 446.109＊＊

2.3 各组大鼠血清中BALP和OC水平比较 8周时，A组BALP、OC均高于B组；C、D组高于B组，E组高于C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

Table 3 Comparison of serum levels of BALP and OC between five groups of rats表35组大鼠血清中BALP和OC的水平比较（n=10s）

Table 3 Comparison of serum levels of BALP and OC between five groups of rats表35组大鼠血清中BALP和OC的水平比较（n=10s）

组别A组B组C组D组E组F BALP（ng/L）52.36±1.10 21.41±3.12a39.93±2.21ab29.65±2.33abc54.61±2.64abcd366.309＊＊OC（μg/L）76.27±1.73 62.51±2.51a70.67±1.83ab74.88±1.63bc78.42±2.24abcd97.291＊＊

3 讨论

3.1 降钙素对牙槽骨丧失的影响 降钙素是甲状腺C细胞产生的一种调节钙磷代谢的多肽激素，其能促进骨骼吸收血浆中的钙，使血钙降低，从而抑制破骨细胞对骨的吸收。降钙素受体的活化是通过抑制核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）实现的[3]。RANKL是激活破骨细胞的重要因素，能促进破骨细胞的活化和对骨组织的吸收。降钙素通过阻断RANKL途径来促进骨组织的形成。本研究对牙周炎大鼠给予降钙素处理后，其PD和牙槽骨丧失程度比牙周炎组明显改善，说明降钙素能有效抑制牙周炎症的破骨过程。

3.2 1,25维生素D对牙槽骨丧失的影响 1,25维生素D即1,25-二羟基胆钙化醇[1,25-(OH)2D3]是维生素D的活性形式，现已证实体内大多数细胞都含有维生素D受体[4-5]。1,25维生素D可调节小肠、肾脏和骨骼对钙的吸收与代谢，促进骨骼生长和重构[6]。本研究对牙周炎大鼠给予1,25维生素D处理后，发现PD明显减小，牙槽骨丧失程度也明显改善，说明1,25维生素D对牙周炎症引起的牙槽骨吸收也有一定的抑制作用。

3.3 降钙素与1,25维生素D联合用药对牙槽骨丧失的影响 本研究发现联合用药组的PD和牙槽骨丧失水平较单一用药组显著减少，提示联合用药比单纯降钙素和1,25维生素D更能促进牙周炎大鼠牙槽骨成骨细胞的活性和功能。因为降钙素能抑制破骨细胞对骨的吸收，1,25维生素D能促进小肠、肾脏和骨骼对钙的吸收，促进骨的生长，两者联用可起到协同效应，共同抑制牙周炎导致的牙槽骨的吸收。

BALP作为成骨细胞的一种细胞外酶，在成骨细胞的成熟期合成，由成骨细胞分泌，其含量变化能直接反映成骨细胞活性。OC由成骨细胞在其基质矿化期分泌产生，具有促进骨矿化的作用。本研究发现降钙素和1,25维生素D均能提高牙周炎大鼠血清中BALP和OC水平，联合用药组BALP与OC水平均高于降钙素组和1,25维生素D组，提示降钙素和1,25维生素D可能通过提升血清中的BALP和OC来促进骨的形成，且联合用药比单纯用药更能促进骨的形成。

[1] Genco RJ,Borgnakke WS.Risk factors for periodontal disease[J]. Periodontol 2000,2013,62(1):59-94.

[2] 吴世莲,刘丽.牙周炎动物模型的研究概况[J].口腔医学,2006, 26(5):385-387.

[3]Newa M,Bhandari KH,Tang L，et al.Antibody-mediated“universal”osteoclast targeting platform using calcitonin as a model drug [J].Pharm Res,2011,28(5):1131-1143.

[4]Daniel D,Bikle.VitaminD and bone[J].Curr Osteoporos Rep,2012,10 (2):151-159.

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[6] Bergwitz C,Juppner H.Regulation of phosphate homeostasis by PTH,vitamin D,and FGF23[J].Annu Rev Med,2010,61:91-104.

（2013-05-06收稿 2013-08-08修回）

（本文编辑 李鹏）

Observational Study of Calcitonin and 1,25 Vitamin D Preventing Periodontitis-Induced Alveolar Bone Loss in Rats

XU Chongyou,MA Yanhua,SHENG Junman,YIN Kai
The First Central Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300192,China

ObjectiveTo evaluate the effects of calcitonin and 1,25 vitamin D on the bone loss in experimental periodontitis in rats.MethodsA total of 125 male Wistar rats were randomly allocated to five groups according to the treatments during 8 weeks:normal control(group A,n=25),periodontitis(group B,n=25),calcitonin(group C,prepared in sterile saline at 2 mg/L,and 2 μg/kg was administered daily,s.c.,n=25),1,25 vitamin D(group D,prepared in corn oil daily at a concentration of 2 mg/L,and 2 μg/kg was administered daily,p.o.,n=25),1,25 vitamin D plus calcitonin(group E,n= 25).The experimental model of periodontitis was induced by ligating floss around mandibular first molars with orthodontic wires in B，C，D and E groups.Five rats from each group were sacrificed,and the specimens were prepared at 2,4,6 and 8-week.The probing depth(PD)and alveolar bone level were observed.The serum bone-specific alkaline phosphatase(BALP) and osteocalcin(OC)were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)at 8-week in each group.ResultsThe values of PD were significantly lower after 4,6 and 8 weeks in E group than those of B,C and D groups(P＜0.05).The alveolar bone loss was significantly lower after 6 and 8 weeks in group E compared with that of B,C and D groups(P＜0.05). The serum levels of BALP and OC were significantly higher after 8 weeks in E group than those of B,C and D groups(P＜0.05).ConclusionThe present study suggests that 1,25 vitamin D and calcitonin can partially inhibit the alveolar bone loss induced by periodontitis.Especially,the application of both is more effective than either drug treatment alone.

periodontitis；calcitonin；dihydroxycholecalciferols；alveolar bone loss；osteocalcin；alkaline phosphatase；1，25 vitamin D

R781.4

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.021

天津医科大学一中心临床学院（邮编300192）

△通讯作者 E-mail:ykxx5253@163.com