MMP-9和Ki67在胰腺癌中表达的意义

孙 宇 孙 宁 杨绍时 宋国栋 陈剑秋

MMP-9和Ki67在胰腺癌中表达的意义

孙 宇 孙 宁 杨绍时 宋国栋 陈剑秋

目的 探讨胰腺癌中基质金属蛋白酶（MMP）-9与Ki67表达的相关性及其临床意义。方法采用S-P免疫组化染色技术，检测100例胰腺癌中MMP-9及Ki67的表达情况，分析其表达水平与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、分化程度及术后生存时间的相关性。结果100例胰腺癌中，MMP-9高表达46例（46%），Ki67高表达53例（53%），且淋巴结有转移、TNM分期级别高、病理分化程度低患者的MMP-9和Ki67的表达高于无淋巴结转移、TNM分期级别低和病理分化程度高的患者（P＜0.05），不同年龄、肿瘤直径间MMP-9和Ki67的表达差异无统计学意义。MMP-9与Ki67表达呈正相关（rs=0.405，P＜0.05）。生存结局与年龄、淋巴结转移、病理分化程度、MMP-9表达相关，与肿瘤大小、局部浸润及Ki67表达无关。结论MMP-9与Ki67表达在胰腺癌的侵袭中起协同作用。MMP-9表达对于判断预后和指导治疗具有一定的临床价值。

胰腺肿瘤；基质金属蛋白酶9；Ki-67抗原；免疫组织化学；预后

胰腺癌发病隐匿，病情发展迅速，病死率高。肿瘤微环境中富含胶原的纤维反应可能与胰腺癌的侵袭、转移相关[1]。基质金属蛋白酶（MMP）-9属于基质金属蛋白酶家族（MMPs），能够降解肿瘤微环境中的多种蛋白胶原，促进肿瘤侵袭[2]。Ki67是一种与增生相关的标志物，在细胞周期的G1、S和G2期达到高峰，而在G0期缺失，在许多肿瘤中高表达[3]。本研究采用免疫组化S-P法检测了100例胰腺癌中MMP-9及Ki67的表达，旨在探讨其在胰腺癌中的相关性及临床意义。

l资料与方法

1.1 一般资料 选择2005年1月—2007年12月我院收治的胰腺癌患者127例。除外类癌6例，失访20例，非胰腺癌死亡1例，共有临床病理资料完整的胰腺导管腺癌100例，均接受手术治疗，术前未接受放化疗。其中男68例，女32例，年龄40～82岁，中位年龄58.66岁。均接受术后化疗。按胰腺癌的国际临床分期标准（AJCC，2010），分为Ⅰ期44例，Ⅱa期24例，Ⅱb期32例。根据WHO标准分型，均为胰腺腺癌；其中伴淋巴结转移者32例，不伴淋巴结转移者68例；高分化癌12例，中分化癌52例，低分化癌36例。

1.2 免疫组化检测方法 所有标本均经福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，片厚4 μm，采用免疫组化S-P法染色，DAB显色，鼠抗人MMP-9、Ki67单克隆抗体，DAB显色试剂及免疫组化S-P法试剂盒，均购自北京中杉生物技术有限公司。采用ABC法，用DAB显色，经苏木精复染，常规光镜观察。结果判定采用半定量积分法，即根据每张切片的阳性细胞比例及着色深浅记分。用PBS代替一抗作阴性对照，阳性对照为已知的胰腺癌阳性片。肿瘤组织染色判定标准：（1）根据阳性细胞百分比分为5级：0分，无染色；1分，染色细胞1%～24%；2分，25%～49%；3分，50%～74%；4分，≥75%。（2）根据染色强度分为4级：0分不着色；1分浅黄色；2分棕黄色；3分深棕色。每份切片记分=染色细胞数分数+染色强度分数。所得分数＜5分为低表达，≥5分为高表达。

1.3 随访 对本组100例胰腺癌患者均进行了随访。局部复发通过肿块局部切除送病理检查证实，远处转移通过体检、X线、B超及CT等证实。

1.4 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计数资料行χ2检验、Fisher确切概率检验。各指标间表达强度的相关关系采用Spearman等级相关分析，生存时间影响因素分析采用COX回归，不同表达水平的生存时间比较用Kaplan-Meier法。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 胰腺癌原发灶MMP-9及Ki67的表达情况 Ki67定位于细胞核，见图1，MMP-9定位于细胞浆，见图2。100例胰腺癌中，MMP-9高表达46例，Ki67高表达53例，且淋巴结有转移、TNM分期级别高、病理分化程度低患者的MMP-9和Ki67的表达高于无淋巴结转移、TNM分期级别低和病理分化程度高的患者（P＜0.05），不同年龄、肿瘤大小间MMP-9和Ki67的表达差异无统计学意义，见表1。

Figure 1 The expression of Ki67 in pancreatic cancer cells (immunohistochemistry,×200)图1 Ki67在胰腺癌细胞内表达（免疫组化染色,×200）

Figure 2 The expression of MMP-9 in pancreatic cancer cells (immunohistochemistry，×200)图2 MMP-9在胰腺癌细胞内表达（免疫组化染色，×200）

Table 1 The high expressions of MMP-9 and Ki67 in pancreatic cancer表1 胰腺癌原发灶MMP-9及Ki67的高表达情况例（%）

2.2 胰腺癌原发灶MMP-9与Ki67表达的相关性 Ki67高表达的53例中MMP-9高表达38例，低表达15例。Ki67低表达的47例中MMP-9高表达8例，低表达39例，MMP-9与Ki67表达呈正相关（rs= 0.405，P＜0.05）。

2.3 MMP-9及Ki67表达与胰腺癌患者术后结局的关系 COX回归协变量分别为淋巴结转移（有=1，无= 0）、肿瘤大小（≥2 cm=1，＜2 cm=0）、局部浸润（有=1，无=0）、MMP-9及Ki67（高低表达分别赋值1、0）、病理分化程度（低、中、高分别赋值0、1、2）和年龄，结果显示术后不良结局与年龄、淋巴结转移、病理分化程度、MMP-9表达相关，与肿瘤大小、局部浸润以及Ki67表达无关，见表2。MMP-9高表达患者的生存时间低于低表达患者（χ2=30.506，P＜0.01），见图3。

Table 2 The COX analysis of overall survival after the surgery of pancreatic cancer表2 胰腺癌术后生存时间的COX分析

Figure 3 Comparison of overall survival after the surgery between two groups with different expression levels of MMP9图3 MMP-9两个表达水平的术后生存率比较

3 讨论

胰腺癌在生物学行为上具有高度侵袭性，早期即可出现周围血管、神经以及淋巴结的浸润转移，甚至远处转移。其中胰腺癌肿瘤细胞的高侵袭性可能与MMP-9对细胞外基质的降解相关[4]。本研究通过免疫组化的方法证实了MMP-9及Ki67在胰腺癌细胞中呈高表达，其中46%的胰腺癌细胞中高表达MMP-9，53%的胰腺癌细胞中高表达Ki67，并且这两种蛋白的表达呈正相关。MMP-9及Ki67的表达强度与胰腺癌TNM分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度相关。

MMPs是一组锌离子依赖性的内肽酶，属于蛋白水解酶的一种，几乎能降解细胞外基质的所有成分。近年来的实验研究发现MMP在恶性肿瘤的侵袭及转移中发挥着重要作用。目前，MMPs家族由11个成员组成。根据其结构和底物特异性将其划分成4组：胶原酶、白明胶酶、基质降解酶及其他。MMP-9又称为明胶酶B，是MMPs中分子质量最大的酶。以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，降解、破坏靠近肿瘤表面的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶，然后肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围浸润，最终导致肿瘤的侵袭和转移。另一方面则通过毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤浸润和转移[5]。已有证据表明，MMP-9在胰腺癌中高表达，且与肿瘤淋巴转移相关，本实验结果与其基本一致[6-7]。因此，MMP-9在胰腺癌细胞浸润、转移中起重要作用。

Ki67是一种细胞核非组蛋白，其普遍表达于增生期细胞而在静止细胞中缺失，因此Ki67可作为细胞增生的一种生物标志。Ki67对细胞分裂的确切功能还不十分清楚，但是其在有丝分裂的G1、S、G2期达到高峰，而在G0期缺失[3]。Laird等[8]的研究表明Ki67在肾癌中的表达明显低于其肝转移灶中的表达，说明Ki67与肿瘤的转移相关。

关于MMP-9和Ki67与胰腺癌预后的关系，观点尚未统一。本研究结果显示，预后结局与年龄、淋巴结转移、病理分化程度、MMP-9表达相关，与肿瘤大小、局部浸润及Ki67表达无关，提示MMP-9的表达可作为判断胰腺癌患者预后的参考指标之一，而Ki67并不能独立影响胰腺癌术后生存时间，因此MMP-9高表达的胰腺癌患者术后需要更密切的观察及综合辅助治疗。

[1]Dangi-Garimella S,Sahai V,Ebine K,et al.Three-dimensional collagen i promotes gemcitabine resistance in vitro in pancreatic cancer cells through hmga2-dependent histone acetyltransferase expression[J].PLoS One,2013,8(5):e64566.

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[3]Weigel MT,Dowsett M.Current and emerging biomarkers in breast cancer:Prognosis and prediction[J].Endocr Relat Cancer,2010,17 (4):R245-262.

[4]郭仁德,王伟忠,顾建华,等.胰腺癌细胞中GDNF对MMP-9表达的影响[J].天津医药,2013,41(1):1-4.

[5]Kuhlmann KF,van Till JW,Boermeester MA,et al.Evaluation of matrix metalloproteinase 7 in plasma and pancreatic juice as a biomarker for pancreatic cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(5):886-891.

[6]Giannopoulos G,Pavlakis K,Parasi A,et al.The expression of matrix metalloproteinases-2 and-9 and their tissue inhibitor 2 in pancreatic ductal and ampullary carcinoma and their relation to angiogenesis and clinicopathological parameters[J].Anticancer Res, 2008,28(3B):1875-1881.

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（2013-07-05收稿 2013-09-20修回）

（本文编辑 魏杰）

The Differential Expression of MMP-9 and Ki67 in Pancreatic Cancer

SUN Yu,SUN Ning,YANG Shaoshi,SONG Guodong,CHEN Jianqiu
Department of Surgery,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

Objective To investigate the expression and significance of MMP-9 and Ki67 for predicting the progression and prognosis of pancreatic cancer.MethodsS-P immunohistochemical method was used to detect the expressions of MMP-9 and Ki67 in 100 pancreatic cancer tissue specimens.The relationship between the expressions of MMP-9 and Ki67 and patient age,tumor size,lymph node metastasis,tumor differentiation,clinical stages and prognosis were analyzed.ResultsThere were higher expressions of MMP-9 protein 46%(46/100)and Ki67 protein 53%(53/100)in 100 samples of pancreatic adenocarcinoma.And the expressions of MMP-9 and Ki67 were inversely associated with tumor differentiation, clinical stages,and lymph node metastasis of pancreatic cancer(P＜0.05).There were no significant differences in the expressions of MMP-9 and Ki67 between patient age and tumor size.The expressions of MMP-9 and Ki67 were positive correlated(rs=0.405，P＜0.05).Moreover,the overall survival rates were correlated with patient age,lymph node metastasis,tumor differentiation and the expression of MMP-9,but no correlation with tumor size,clinical stages,and the expression of Ki67.ConclusionThe expressions of MMP-9 and Ki67 were associated with pancreatic cancer progression.And the detection of expression of MMP-9 may have practical value in prognosis in patients with pancreatic cancer．

pancreatic cancer;MMP-9;Ki67;immunohistochemistry;prognosis

R735.9

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.014

天津医科大学第二医院外科（邮编300211）