细胞色素P450酶17基因多态性与迟发型男性性腺功能减退症的相关性研究

李保山，宋青青，朱翔，沈国栋，乔洁，任安，康冬梅

（1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a干部病房，b老年医学研究所，c内分泌科，合肥 230001；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科）

细胞色素P450酶17基因多态性与迟发型男性性腺功能减退症的相关性研究

李保山1a，宋青青1a，朱翔1a，沈国栋1b，乔洁2，任安1c，康冬梅1a

（1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a干部病房，b老年医学研究所，c内分泌科，合肥 230001；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科）

目的探讨细胞色素P450酶17（CYP17）基因多态性与迟发型男性性腺功能减退症（LOH）的关系，研究LOH的发病机制。方法纳入年龄在49～79岁的中老年男性356例，其中36例诊断为迟发性性腺功能减退症患者，随机抽取130例正常健康中老年男性，测量身高、体质量、腰围（WC）、血压，测定三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、血清总睾酮（T）、雌二醇（E2），并应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测CYP17基因多态位点的片段，产物在2%琼脂糖凝胶上电泳确定出CYP17基因型，比较两组各指标之间的差异。结果CYP17基因呈多态性：A1／A1、A1／A2和A2／A2。正常健康中老年男性的SBP、BMI、TG、TC和，FBG较LOH患者低（P＜0.05），而T和T／E2比值较LOH组显著升高（P＜0.01），两组间E2差异无统计学意义（P＞0.05）。正常健康中老年男性组CYP17不同基因型之间T和T／E2比值差异无统计学意义（P＞0.05）；LOH组CYP17不同基因型之间T和T／E2比值差异有统计学意义（P＜0.05），两组不同基因型之间E2差异无统计学意义（P＞0.05）。LOH组较正常健康中老年男性组CYP17基因杂合变异型A1／A2呈现低频率分布（33.3%），而纯合变异型A2／A2呈高频率分布（47.3%），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论CYP17基因多态性可能与LOH患者的T水平有关，低水平的T和T／E2比值可能是LOH发病的危险因素。

性腺功能减退症；类固醇17-α-羟化酶；多态性，单核苷酸；危险因素

随着全球人口老龄化的进展，中老年男性健康问题成为国内外研究的热点问题。而迟发性性腺功能减退症（LOH）起病隐匿，更成为医疗工作者重点关注的疾病之一，其病因和发病机制复杂，至今尚未明确［1-2］。衰老过程中造成中老年男性细胞色素P450酶17（CYP17）基因的变异可能与LOH有关。本研究拟通过探讨CYP17基因多态性与LOH的相关性，分析CYP17基因多态性在LOH发病过程中的作用。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选择2012年1月至2012年12月在安徽省立医院体检的40～79岁中老年男性356例，平均年龄（59.4±7.7）岁。测量身高、体质量、腰围（WC）、血压（BP），测定三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、血清总睾酮（T）、雌二醇（E2），同时采用AMS量表（the Aging Male Symptoms Scale）电话问卷调查后，诊断为LOH者36例。随机抽取130例正常健康中老年男性作为健康对照组。纳入标准：①40～79岁安徽本地中老年男性居民；②自愿接受问卷和血液学检查者；③LOH阳性诊断标准参照《2011年LOH诊疗指南》标准：相关临床症状评分达标同时伴血清睾酮水平低下的切点值：T≤11.5 nmol／L。排除标准：①近期（3个月）内接受过激素治疗；②肝肾功能不全；③肿瘤患者；④严重酗酒者；⑤体质量指数（BMI）＞30。正常人群组130例为相关临床症状评分和血清T水平均在正常范围。所有入选者均为安徽本地人群，研究个体之间无血缘关系，并签署知情同意书。

1.2 标本采集 上午8：00～9：00留取静脉血，总量10 mL；2 mL直接分离血清在生化实验室全自动生化分析仪测空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）；4 mL分离血清由德国西门子公司全自动化学发光免疫分析仪（型号：650102）测定睾酮（T）、雌二醇（E2）；4 mL以EDTA抗凝，冻存于-80℃冰箱，以提取DNA。

1.3 外周血DNA的提取 静脉血中分离白细胞，用全血DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取基因组DNA。

1.4 目的片段的PCR扩增 多态性片段PCR扩增使用引物为CYP17 F：5′-CATTCGCACCTCTGGAGTC-3′，R：5′-GGCTCTTGGGGTACTTG-3′［3］。PCR反应体系为25μL，包括DNA模板50 ng、引物20 pmol、100μmol dNTPs、1×反冲液、1U Taq聚合酶。PCR反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。将PCR产物用MspA1I在37℃下消化3 h后进行酶切。反应混合物包括PCR产物15μL、BSA 0.25μL、10×NE Buffer 2.5 μL、内切酶MspA 1Ⅰ0.5μL、。酶切反应在Eppendorf管中进行，2%的琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切产物。

1.5 DNA测序 采用标记引物的双脱氧末端终止法，纯化后的PCR产物经DNA自动测序仪（ABI3730XL）直接测序将测序结果与Genebank数据库中CYP17基因相应序列比对。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量资料运用t检验进行统计分析，计数资料采用χ2检验。

表1 入选人群一般情况分析

表3 健康对照组和LOH组CYP17不同基因型之间激素水平的比较（±s）

表3 健康对照组和LOH组CYP17不同基因型之间激素水平的比较（±s）

注：A1／A1：野生纯合子等位基因；A1／A2：杂合变异体；A2／A2：纯合变异体；正常健康中老年男性组CYP17不同基因型之间T、E2和T／E2比值比较，P＞0.05；LOH组CYP17不同基因型之间T和T／E2比值比较，P＜0.05，而不同基因型之间E2比较，P＞0.05

T（nmol／L）组别例数E2（pmol／L）T／E2A1／A1 A1／A2 A2／A2健康对照组130 12.94±2.38 13.05±2.36 13.12±2.24 51.57±18.21 52.78±18.34 53.82±18.28 0.25±0.09 0.2 A1／A1 A1／A2 A2／A2 A1／A1 A1／A2 A2／A2 04 0.11±0.02 6±0.01 0.25±0.08 LOH组36 7.65±1.32 7.31±1.29 6.51±1.34 51.34±17.11 52.37±18.31 52.57±17.21 0.15±0.05 0.12±0.

2 结果

2.1 CYP17基因型 CYP17基因型产物表现出3种类型，即3种基因型，纯合子（A1／A1）、杂合子（A1／A2）和纯合子（A2／A2）。

2.2 一般情况分析 入选人群分为健康对照组和LOH组，健康对照组130例，LOH组36例，两组之间一般情况比较，见表1。两组在年龄、WC、舒张压（DBP）之间差异无统计学意义（P＞0.05）；而BMI、收缩压（SBP）、TG、TC、FBG之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 性激素水平比较 LOH组患者T浓度和T／E2比值与健康对照组相比显著降低（P＜0.01），而E2水平两组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 两组之间性激素水平比较（±s）

表2 两组之间性激素水平比较（±s）

注：与健康对照组比较，aP＜0.01，bP＞0.05

组别例数T（nmol／L）E2（pmol／L）T／E2健康对照组130 14.12±2.24 51.78±18.34 0.26±0.07 LOH组36 7.66±2.32a52.42±24.78b0.12±0.02a

2.4 CYP17不同基因型之间激素水平的比较 见表3。

表4 两组CYP17基因型分布和等位基因频率

2.5 两组CYP17基因型分布和等位基因频率与LOH的危险性 见表4。

3 讨论

男性血清T水平与代谢综合征可能存在一定的联系［4］，血清T可能参与调节血糖及脂肪代谢，T水平下降可以导致血糖及脂肪代谢紊乱，进而诱发糖尿病、高血压和血脂升高［5-6］。在本研究中发现，LOH患者的BMI、SBP、TG、TC和FBG的指标高于健康对照组，这与Svartberg等［6］和Vermeulen等［7］的研究结果一致。

LOH患者CYP17基因多态性的研究在国内尚未见相关报道。本研究结果显示，CYP17基因呈多态性，LOH组杂合变异型A1／A2（33.3%）和纯合变异型A2／A2（47.3%）较健康对照组杂合变异型A1／A2（48.5%）和纯合变异型A2／A2（15.3%）有显著改变（P＜0.05），而且LOH组变异等位基因A2（63.9%）较健康对照组变异等位基因A2（39.6%）呈高频率表达，有显著性差异（P＜0.05）。同时，与正常健康中老年男性组相比LOH组CYP17不同基因型之间T和T／E2比值有显著性差异（P＜0.05），提示CYP17基因多态性可能与LOH患者T水平有一定的关系，变异等位基因A2的高表达可能导致细胞色素P450c17A酶结构和功能缺陷，进而导致T的水平降低。

LOH发病机制目前仍不是十分清楚，表现为男性老龄化及伴随雄激素水平下降，并且其发病受遗传和环境等多方面因素影响［8］，而CYP17基因多态性与LOH关系的研究目前还处于起步阶段［9-11］。本研究结果显示，LOH患者CYP17基因呈现变异等位基因A2高频率，初步推测CYP17基因突变可能与LOH发病有关，突变等位基因A2导致的T水平和T／E2比值降低可能是LOH的发病因素，但仍需要大量的研究进一步的证实。

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The association between polymorphism of CYP17 gene and late-onset male hypogonadism

LI Baoshan*，SONGQingqing，ZHU Xiang，SHEN Guodong，QIAO Jie，REN An，KANG Dongmei（*CadresWard，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei230001，China）

KANG Dongmei，Email：kangdongmei2006＠sina.com

ObjectiveTo investigate the association between the polymorphisms in CYP17 gene with lateonsetmale hypogonadism（LOH）and explore the pathogenesis of LOH.MethodsThe investigation involved 356men aged 40-79 years，including 36 caseswith LOH.130 healthymiddle-agedmaleswere random ly selected.The body mass index（BMI），height，waist circum ference（WC）and blood pressure weremeasured and the levels of Triglyceride（TG），serum total cholesterol（TC），fasting blood glucose（FBG），serum total testosterone（T），serum estradiol（E2）were also detected.The polymorphisms of CYP17 gene were examined by PCR.ResultsThe polymorphisms of CYP17 gene were A1／A1，A1／A2 and A2／A2.Themean SBP，BMI，TG，TC and FBG in the healthy males were significantly lower（P＜0.05），whileT and T／E2ratio weremarkedly higher compared with the LOH males（P＜0.01），There was no significant difference in the level of E2between the two groups（P＞0.05）.There were no significant difference in the levels of serum T and T／E2ratio of the different CYP17 genotypes in the normalmiddle-aged males（P＞0.05），while significant difference was found in the different CYP17 genotypes in LOH males（P＜0.05），and there was no significant difference in the level of E2in the different CYP17 genotypes between the two groups（P＞0.05）.Heterozygous variants（A1／A2）of CYP17 were present in less frequency（33.3%）and homozygous（A2／A2）variants were higher frequently（47.3%）found in LOH，and the results were significant（P＜0.05）.ConclusionPolymorphisms in CYP17 genemay be associated with serum T concentrations in LOH cases，and low levels of serum T and T／E2ratiomight possibly act as risk factors for LOH.

Hypogonadism；Steroid 17-alpha-Hydroxylase；Polymorphism，Single Nucleotide；Risk Factors

R588

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.02.011

2014-01-04）

安徽省2008年度重点科研计划（08020303073）；安徽省科技计划项目（12010402134）

李保山，硕士在读，Email：lbs622＠163.com

康冬梅，教授，硕士生导师，Email：kangdongmei2006＠sina.com