人体淋巴母细胞建株方法的改进研究

熊乐琴 马昌杯 李善妮 帅云飞

随着人类社会的发展, 遗传多样性的保存显得尤为重要,对于全球性生物多样性研究具有重大意义。人类突变细胞是研究人类生物学特征的重要资源, 也是在细胞水平上开展遗传病研究的宝贵材料。在传统的淋巴母细胞建株方法的基础上, 作者于2012年1月～2013年12月对此进行了改进, 效果明显, 建株时间在18 d左右, 且成功率保持在95%以上,有效提高了淋巴母细胞建株的成功率, 缩短了建株时间, 操作简便, 为人类突变细胞的收集、保存以及遗传资源的保存创造了有利条件, 值得推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料 1640培养基(pH7.2±0.1)、谷氨酰胺(glutamine)、血清、环孢霉素(Ciclosporin)、淋巴细胞分离液(lymphocyte isolation)、EB病毒。

1.2 EB病毒的制备 方法一：选取B95-8细胞, 用前1天内进行换液, 并反复冻融2～3次, 将收集的上清液进行过滤,4～5℃保存。方法二：运用传统方法对EB病毒进行制备,-70℃保存。

1.3 人类淋巴母细胞建株 取外周血4～5 ml, 与2～3 ml 1640培养基(pH 7.2±0.1)在离心管中进行混合, 并将混合液注入置含有2～3 ml淋巴细胞分离液的离心管中, 待静置1 min后,离心后分离淋巴细胞, 洗涤3次, 注入培养液(1 mmol/L谷氨酰胺, 25%血清) 6 ml, 随机平均分为6份, 共3组。①、②组加入0.5 ml血清以及方法一制备的EB病毒1 ml, ③组加入传统方法制备的EB病毒1 ml；每份加入适量环孢霉素, 轻轻混匀。①组、②组采取36℃开放式培养, 2 d后半量换液,并加入适量环孢霉素和EB病毒, 保持环孢霉素的浓度, 此后每隔3 d进行换液；7 d后对①组标本行活细胞分离, 待细胞数达到目标范围后进行细胞核型分析以及冻存。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行数据的统计学分析, 成功率比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 69例淋巴母细胞标本建株情况 对比分析三组淋巴母细胞建株的成功率, 其中①组的建株成功率最高, 为91.3%；③组成功率最低, 为39.1%, 详见表1。

表1 各组淋巴母细胞建株成功率比较(n, %)

2.2 淋巴母细胞的生长状况 ①组、②组3 d后可发现大量细胞生长迅速, 少量细胞死亡；5 d后可发现大量细胞呈团块状, 团块表面存在黑色颗粒, 折光度减小, 中间存在少量活细胞；7 d后现象更为明显。①组经活细胞分离后, 细胞的生长速度加快, 而②组则生长缓慢；③组在4～6 d后可发现部分细胞粘于瓶壁, 有少量悬浮的细胞团块, 折光度低,存在大量的死细胞, 细胞生长缓慢。

3 讨论

EB病毒可以选择性地将B淋巴细胞进行转化, 环孢霉素可以在细胞的G0、G1期选择性抑制T淋巴细胞中的RNA聚合酶Ⅱ的活性, 从而有效阻断T细胞的繁殖, 避免已经转化的B淋巴细胞由于T淋巴细胞的介入而导致退化［1］。采用方法一制备EB病毒是当B95-8细胞达到平台期后采集EB病毒, 由于此时的B95-8细胞能释放出大量的EB病毒,因此感染力强, 效果明显；采用方法二制备EB病毒, 并将其置于-70℃储存, 大量的EB病毒会失去自身的感染力, 在开始阶段, 难以转化成B淋巴细胞, 效果较差［2］。2 d后, 由于经EB病毒感染后的T淋巴细胞大部分仍然具有应答反应,另有一些T淋巴细胞未受到环孢霉素的干扰, 因此, 需往培养液中添加适量的环孢霉素以及EB病毒。培养5d后, 由于大部分B淋巴细胞转化充分, 且T淋巴细胞由于受到环孢霉素的干扰逐渐退化, 甚至死亡, 并释放出多种酶以及大量的细胞碎片, 这些酶以及细胞碎片一定程度上会影响B淋巴细胞的增殖, 甚至导致已经转化的B淋巴细胞退化、凋亡。将建株成功的标本静置培养1周, 可在试管底部的沉降细胞周围发现生长晕, 进行半量换液后, 9～11 d转瓶, 显微镜可观察到胞质突出、聚集成团、形态各异的细胞株, 此后4～6 d传代一次, 经过5～6次传代后可使细胞悬液达到60 ml左右,即可冻存。此次研究表明, ①组加入的淋巴细胞分离液可以促进淋巴细胞的进一步分离, 去除有害物质以及坏死细胞,从而加快了B淋巴细胞的生长速度, 提高了淋巴母细胞的建筑成功率, 缩短了建株时间, 其效果要明显好于②组、③组。

［1］ 陈宝安, 马金龙, 刘苒, 等.bcr-abl融合基因阳性慢性髓系白血病继发髓外T淋巴母细胞病变一例报告附文献复习.中华血液学杂志, 2011, 32(10): 693-694.

［2］ 莫小辉, 宋宁静, 陈佳, 等.EBV转化带状疱疹患者外周血B淋巴母细胞系的建立.免疫学杂志, 2013, 29(7): 615-618.