盐胁迫对桑叶中1脱氧野尻酶素含量的影响

丁俊男　迟德富

摘要 [目的]考察盐胁迫对桑叶中1脱氧野尻酶素含量的影响。[方法]以黑龙江省桑树品种青龙桑为试验材料，采用不同盐浓度下对桑苗进行盐胁迫处理，利用高效液相色谱测定1脱氧野尻酶素的含量。[结果]不同浓度的NaCl胁迫下桑树叶片的1脱氧野尻酶素含量均高于对照，其中50 mmol/L NaCl溶液处理下桑树叶片中1脱氧野尻酶素含量在第31天达到最大值，为1.51 mg/g；并且，在NaCl胁迫下桑树上部叶的1脱氧野尻酶素含量大于下部叶。[结论]适当的盐浓度能有效提高桑苗叶片中1脱氧野尻酶素的含量。

关键词 桑树（Morus alba L.）；盐胁迫；1脱氧野尻酶素；含量测定；高效液相色谱

中图分类号 S888.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）08-02315-03

Effects of Salt Stress on 1DNJ Content in Mulberry Leaf

DING Junnan， CHI Defu

（College of Life Science， Northeast Forest University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To investigate effects of salt stress on 1DNJ content in mulberry leaf. [Method] With Heilongjiang mulberry variety Qinglongsang as test material， different concentration salt stress treatments were conducted. HPLC method was used to determine 1DNJ content. [Result] The results showed that the DNJ contests of mulberry is higher than CK under the salt stress， and 50 mmol/L NaCl mulberry leaf in solution with DNJ contents reach maximum 1.51 mg/g after 31 days. Under NaCl stress， 1DNJ content in upper leaves of mulberry is higher than that of the lower leaves. [Conclusion] The appropriate salt concentration can effectively improve 1DNJ content in mulberry leaf.

Key words Mulberry； Salt stress； 1 Deoxynojirimycin； Content determination； High performance liquid chromatography

桑属植物桑（Morus alba L.）作为传统中药始载于《神农本草经》，在我国已有数千年的栽培历史，根皮、枝叶、果实等皆可入药，具有重要的药用价值[1]，特别是近年来桑树中1脱氧野尻霉素（1deoxynojirimycin，DNJ）的研究引起国内外注意。其化学结构与α1，4葡萄糖类似，具有降血糖的作用，在糖尿病、肥胖症和病毒感染等疾病方面显示出明显药理作用[2]。DNJ是植物的次生代谢产物，是植物对环境适应而产生的代谢产物，也是植物防御逆境灾害的防御机制之一，在调节植物与生态环境的关系中起一定作用。很多植物次生代谢物都有治疗疾病的功能，也是医药产品和化学产品的来源[3-7]。许多药用植物在受到外界刺激后，能够明显提高甚至合成很多药用次生代谢产物，并且这些药用物质还会有化学防御作用的物质，通常称之为植保素（phytoalexin）。DNJ在干旱、盐碱和低温等逆境条件下能有效的积累。对于植物体本身而言，DNJ的积累主要用于自身对逆境的防御，还可用于药物的开发。目前，有关桑树不同种类、不同品种、同一品种的不同器官和不同生长季节的DNJ含量测定和变化已有很多研究[8-11]，如：施氮量和氮素形态[12]、光照[13]等对桑树叶片中DNJ含量均有影响。盐胁迫是限制植物生长发育的重要因素[14-15]，特别是目前我国北方地区桑树的推广主要集中在盐碱化程度较高的废弃用地，但目前有关盐胁迫对桑树叶片中DNJ含量的影响方面的研究鲜有报道。为此，笔者探讨不同浓度NaCl胁迫对桑树叶片中DNJ含量的影响，以期为提高桑树DNJ的含量及药用价值提供理论依据，并为指导药用桑树的合理推广栽培提供一些基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。供试桑树（Morus abla L.），品种为2年实生桑苗“青龙桑”，由黑龙江省蚕业研究所提供。

1.1.2

主要仪器。Agilent 1100型高效液相色谱仪，购自Agilent公司。

1.1.3

主要试剂。DNJ标准品和芴甲氧基酰氯（FMOCCl），购自Sigma公司；乙腈和甘氨酸为色谱纯，购自天津基准试剂有限公司；其余試剂均为分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1

色谱条件。色谱柱为C18柱（Hypersil GOLD）；流动相为乙腈-醋酸（55∶45，V/V）；流速为1.0 ml/min；柱温25 ℃；紫外检测器激发波长为254 nm。

1.2.2

样品的初处理。试验于2013年7月在东北林业大学分子生物学实验室进行。2013年5月选取长势一致的桑苗种于35 cm×40 cm的培养钵中，每钵定植一株。选择长势相对一致的30株苗作为试验用苗，于2013年7月1日开始控水5 d，第6天进行盐胁迫处理，各处理分别浇灌浓度为50、100、150、200和250 mmol/L的NaCl溶液，以正常浇水处理为对照，每个处理设5株重复。每个培养钵下放置塑料托盘以防止盐分流失，每隔2 d浇盐溶液1次，每次浇灌1 000 ml。每次浇灌前采集桑树上部叶（1～5叶位）及下部叶（6～10叶位），采收的叶片立即杀青（105 ℃，30 min）后烘干（80 ℃，30 h）至恒质量，烘干的样品经粉碎机粉碎后过80目筛，放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.3

样品的提取。各取不同盐处理桑叶粉0.200 g于2 ml离心管中，加入0.05 mol/L HCl溶液1.0 ml，涡旋混合2 min ，超声波处理40 min，于12 000 r/min离心30 min，收集上清液，沉淀物再按上步重新提取一次，合并2次上清液，定容至2 ml，即得样品提取液。每个处理3个重复。

1.2.4

对照品溶液的制备。精密秤取5.0 mg DNJ标准品于容量瓶中，加入500 ml浓度0.05 mol/L HCl溶液，摇匀即得DNJ标准母液；用蒸馏水将母液配制成1、10、20、30、40、50和60 μg/ml系列标准溶液。

1.2.5

方法学考察。（1）系统适应性试验。取适量对照品溶液和样品溶液，按照“1.2.1”中色谱条件进样，记录色谱图，考察系统适应性。（2）线性关系的考察。取制备的系列标准溶液，分别按照“1.2.1”中色谱条件进样，以DNJ浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，计算线性回归方程。（3）稳定性试验。将桑树叶片的待测液放置于温室条件下，进行衍生化处理之后，分别于0、1、2、4、6、8、12、14和16 h 测定峰面积，利用DNJ标准品浓度和色谱峰面积之间的拟合方程，计算DNJ含量的RSD。（4）重现性试验。精密称取桑叶样品6份，衍生化处理后，进行HPLCUV测定，计算DNJ含量及RSD。（5）加样回收率试验。精密称取已知含量DNJ的桑树样品5份，加入DNJ标准品，衍生化处理后，经HPLCUV测定，计算平均加样回收率和RSD。

1.2.6

衍生化处理。取100 μl待测样品提取液于2 ml离心管中，加入200 μl pH 8.5的0.4 mol/L硼酸钾缓冲液，然后加入250 μl浓度5 mmol/L的FMOCCl（溶于50%的乙腈中）溶液，涡旋混合，于25 ℃恒温水浴箱中反应20 min，加入1 mol/L甘氨酸50 μl中和剩余的衍生化试剂FMOCCl，再加入50 μl体积分数为1%的醋酸溶液，用水定容至刻度；最后用0.45 μm针头过滤器过滤，即可进行HPLCUV检测。标准品溶液衍生化步骤同上。取10 μl进样分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

（1）系统适应性试验。图1表明，在DNJ标准样的色谱图中含有3个吸收主峰，峰1为DNJFOMC，峰2为GLYFMOC，峰3为FMOCOH。待测样品中DNJ与相邻组分之间得到了较好的基线分离。在DNJ衍生化处理中，加入试剂芴甲氧基酰氯（FMOC）后的水解副产物FMOCOH和GLYFMOC均不干扰分析组分的测定。（2）线性关系的考察。以DNJ标准品的浓度（X）和色谱峰面积（Y）绘制标准曲线，并进行线性拟合，得到DNJ浓度与色谱峰面积之间的线形回归方程为：Y=265.17X17.53，R=0.994 6。试验结果表明，在1～60 μg/ml范围内，DNJ浓度与色谱峰面积的线性关系良好。（3）稳定性试验。计算得DNJ含量的RSD为4.01%，表明待测液DNJ在16 h之内基本稳定。（4）重现性试验。计算得DNJ的平均含量为0.861，RSD为2.5%（n=6），表明方法重现性良好。（5）加样回收率试验。由表1可知，平均加样回收率为90.9%，RSD为2.3%，表明该方法准确可靠，可用于桑叶中1脱氧野尻酶素的含量测定。

2.2 盐胁迫对桑树DNJ含量的测定

图2表明，对照组桑树叶片中的DNJ含量始终维持在0.6～0.8 mg/g，不同浓度盐胁迫下桑树叶片中的DNJ含量均明显高于对照。在浓度50 mmol/L的NaCl胁迫下，桑树叶片中的DNJ含量积累表现明显，并且在31 d时达到最大值1.51 mg/g，平均含量为1.11 mg/g。浓度100、150、200和250 mmol/L的NaCl胁迫下桑树叶片中的DNJ含量表现出相同的变化规律，均在处理第21天时达到峰值，分别为1.48、1.29、1.20和1.09 mg/g，并且随着NaCl浓度的增加，桑树叶片中DNJ含量的峰会逐渐降低，胁迫处理21 d后随着胁迫时间的延长，各处理桑树叶片中DNJ含量均呈降低趋势。

2.3 盐胁迫下桑树上部叶与下部叶DNJ含量的测定

图3表明，在整个试验过程中各浓度盐处理的桑叶取上部叶和下部叶进行DNJ含量的测定，结果表明桑树上部叶DNJ含量均大于下部叶含量，其整体DNJ含量变化呈现从升高到降低的趋势，上部叶与下部叶的平均含量分别为0.88和0.75 mg/g。

3 结论与讨论

植物对任何环境的适应都会诱导产生一些形态剖析，物候与生理上的变化[16-17]。适宜的盐度不仅能促进植物的营养生长，而且能促进植物的营养生长，而且能促进某些盐生植物的开花与果实发育。盐胁迫几乎影响植物所有的重要生命过程，如生长、光照、蛋白合成、能量和脂类代谢[18]。通过试验可知，盐胁迫下桑树叶片中1脱氧野尻霉素（1DNJ）均有不同程度的增加，在盐浓度不断积累的情况下呈现出先上升在下降的趋势，并且其总平均含量大于对照。试验还对桑树上部叶与下部叶DNJ含量进行了对比，结果表明上部叶DNJ含量大于下部叶含量，有研究表明桑树上部嫰叶DNJ含量大于下部成熟叶是一种化学防御机制。根据C/N平衡的假设（CNB）可推断出植物在贫瘠的土地上，形成次生代谢产物是一种防御机制。由此可见，适当的盐浓度对桑树DNJ含量的积累有积极作用，DNJ作为一种次生代谢产物，桑树叶片中的DNJ含量在盐胁迫下的大量积累可能具有一些其他的生理功能，有待更进一步的研究。生物碱作为一类重要的次生代谢产物，具有明显生理生物活性，当外部生态环境改变和动物取食时，生物碱可作为一种植物保护剂。在试验过程中，盐胁迫使土壤中的水势下降，造成桑苗的水分亏缺的生理干旱状态影响生长，当试验进行19～21 d时，各试验组的桑苗均出现桑叶变黄，叶片脱落，桑苗对100～250 mmol/L的NaCl高度敏感。

参考文献

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